分支杆菌属
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第429页（9703字）
分支杆菌属是一类平直或微弯的细长杆菌，繁殖时有分支生长趋势。一般不易着色，若加温或延长着色时间使之着色后，即能抵抗酸酒精的脱色作用，故称抗酸性菌。
本属菌无鞭毛和芽孢，菌体内含大量类脂，对营养要求比较特殊，生长缓慢。
本属菌在自然界广泛存在，有的是人、畜、禽的病原菌，有的是变温动物的病原菌和腐生菌。
在兽医上占重要地位的有结核分支杆菌(M．tuberculosis)、牛分支杆菌(M．bovis)、禽分支杆菌(M．avium)和副结核分支杆菌(M．paratuberculosis)。前三种是结核病的病原菌，后者是副结核病的病原菌。
结核分支杆菌主要侵害人，其次为牛和猪，少见于犬。牛分支杆菌主要感染牛，其次是人和猪，少见于马、绵羊和山羊。禽分支杆菌主要侵害家禽，其次是猪，少见于牛和绵羊。副结核分支杆菌感染牛和羊。
一、结核病的微生物学诊断
病畜常不显明显症状。生前主要靠结核菌素变态反应诊断，死后靠病理解剖学诊断，同时配合做细菌学诊断。诊断程序可参照下图。
图18-2 结核病料细菌学诊断程序
病料在镜检和分离培养前，必须经酸碱等处理，并进行浓集。因材料中结核菌较少，常集结成团，镜检不易看到。污染杂菌时，培养不易成功。处理后，可使组织和蛋白质溶化，结核菌散开，经浓集易看到结核菌。
将病变组织磨碎，制成乳剂。痰、体液、奶等尽可能用无菌手续采集。取病组织乳剂或其他液体病料2～4ml，装于离心管中，加倍量4%NaOH后，摇振5～10min，摇至发生液化为止。离心(3000r／min)30min，去上清，加0．02%酚红1滴于沉渣中，用2mol／LHCl中和，至成淡红色为止。然后取沉淀物制成涂片、接种培养基和注射动物。病料也可用6%硫酸或3%HCl处理，用2mol／LNaOH中和。
根据病料污染程度掌握处理时间，与酸碱接触时间太长，结核菌也会死亡。材料污染轻，处理时间应短些，污染重，可长些。
病牛乳可取5ml放离心管中，加乙醚或二甲苯1ml，用力摇振后离心。离心物可分三层，加乙醚结核菌集于中间层，加二甲苯时，集于上层。
如病料为尿，取5ml加入醋酸0．5ml，离心后弃上清，沉淀加两倍无水酒精，离心后沉淀分为3层，取上层镜检。
1．镜检 将病料处理和浓集后，取沉淀作抹片，用萋-尼氏法作抗酸染色(见第四章第二节)。镜检时，于蓝色视野内，发现有红色结核杆菌时，可作初步诊断。但在牛乳、粪便或尿等病料查见抗酸菌时，判定时要慎重。往往需用动物试验或其他方法鉴定，以决定其究竟为结核杆菌或非致病菌，报告时，应写“查见抗酸性菌”为宜。
图18-3 结核分支杆菌图片
2．分离培养 取经处理的病料沉淀物作为培养材料。初次培养常用固体培养基，最好用两种以上。接种时，每一标本同时用4～6管培养基，接种后，斜置于37℃下约一星期，使病料标本充分附着于培养基表面，然后取出换以软木塞，用融化石蜡封口，以防干燥，并继续培养，每周检查培养物1～2次，观察有无细菌生长。同时可将木塞放松通气，以利于结核菌生长。
常用的培养基有潘曲吉尼(Petragnani)培养基、罗森氏培养基、青霉素血琼脂、潘曲夫(Petroff)培养基等。培养2～6周后，人、牛型结核菌生长为干燥、皱缩、灰白或灰黄菌落，培养物在水中不易悬浮。禽型菌菌落较光滑、湿润，培养物在水中易均匀悬浮。
初代培养时，在培养基中加甘油，能促进人、禽型菌生长，对牛型菌无促进作用。
3．动物试验 分离结核菌或研究分离菌毒力和鉴定菌型时用之。多用豚鼠。试验前先作结核菌素试验，即取结核菌素0．1ml腹部皮内接种，经48～72h观察反应，若注射处出现红肿硬块为阳性，阳性反应鼠不宜使用。
试验时取病料或可疑培养物，用生理盐水稀释1∶10，于腹股沟皮下注1ml。三周后见鼠体重减轻，淋巴结肿大，继而死亡，死亡前结核菌素试验阳转时，为接种阳性。将鼠杀死，取病料镜检及分离培养。
如八周后仍无上述反应，则为接种阴性。亦应将鼠杀死观察，取淋、脾、肝涂片镜检，未查见结核菌时，可报告动物试验阴性。
为了鉴定菌种，可将培养物同时接种家兔、豚鼠和鸡。兔在接种牛型菌5周后，死于急性结核病，接种禽型菌10周死亡，但人型菌通常不引起死亡。豚鼠在接种牛型菌后6～8周内死亡，接种人型菌后10～13周内死亡，但接种禽型菌常不引起死亡。鸡当接种禽型菌后，于10周内死亡，而接种牛、人型菌时，不引起死亡。
表18-5 三种结核菌对实验动物的致病力
4．其他鉴别试验 较常用者有接触酶试验、中性红试验和烟酸试验。
(1)接触酶试验 结核菌菌落当混入3%双氧水滴中时，仅产生少许气泡。但非致病性抗酸性菌则产生多量气泡。
(2)中性红试验 鉴别致病菌株与非致病菌株之用。取可疑菌落数个，加入盛有5ml50%甲醇的灭菌试管中，37℃水浴中放1h，取出弃去上清液，加新配的碱性缓冲液(氯化钠5g，巴比妥钠1g，蒸馏水100ml)5ml及0．05%中性红液0．2ml。37℃水浴1h，(每15min振动一次)，取出观察。于淡黄色缓冲液中，菌落呈粉红或红色时为阳性反应，表示为致病菌株。菌落呈黄白或不变色时为阴性反应，表示为非致病性菌株。
(3)烟酸试验 主要鉴别人型菌和牛型菌以及非典型抗酸菌用。在长好细菌的固体培养基上加1．5ml温水，将培养基倾斜浸5min。吸出浸液1ml，移入清洁试管内，加新配的10%溴化氰溶液(有剧毒，必须在毒气厨中操作!)及苯胺乙醇溶液(苯胺4ml，95%乙醇96ml)各0．5ml。浸液呈蜡黄色为人型菌，呈蓝绿色为牛型菌或非典型抗酸菌。
除上述三种结核菌外，尚有许多非典型抗酸性菌，偶尔可从人、畜病灶中分离到。但这些非典型抗酸菌因无传染性，所以不甚重要。为了在必要时进行鉴别起见，列出数种分支杆菌的主要特性表供参考。
5．变态反应诊断 牛结核检疫有三种方法，即皮内法、点眼法和皮下法。我国目前主要采用皮内法和点眼法。应用此法可检出牛群内的95～98%的结核病牛。对育成牛群以采用皮内法为主。
此外，还有利用酶联免疫吸附试验、补体结合反应和被动血凝等法进行诊断，但这些方法还未完善，未能普及应用。
二、副结核病的微生物学诊断
副结核病也称副结核性肠炎，主要发生于牛和羊，病的主要特征是顽固性腹泻和进行性消瘦，病牛肠粘膜增厚，并形成脑回样皱襞。
本病分布广泛，一般养牛地区都可能发生。
表18-6 数种分支杆菌的主要特性比较
本病的病原菌为副结核分支杆菌，大小为0．5～1．5×0．2～0．5μm的革兰氏阳性小杆菌。抗酸染色阳性。在组织或粪便中多成团排列。初次分离比较困难。培养基中加甘油和草分支菌素，有助于生长。
微生物诊断方法如下。
1．镜检 生前取疑似病牛的直肠刮取物(于肛门内30cm左右，刮取粘膜刮下物少许)或取粪便(尽可能取带粘液处)进行镜检。病牛排菌有周期性，必要时，应反复进行几次，以提高检菌率。
病肠段或回盲瓣病料处理法：将肠段剪开，用自来水冲洗，用刀刮取粘膜约10～20g。若为肠淋巴结，先除去外面脂肪，切取10～20g并剪碎。刮取和剪碎组织放入消毒的带铜纱网的乳钵中研磨，边磨边加0．5%胰酶水溶液40ml，使成混悬液，用1mol／LNaOH调pH为9．0，放在烧杯中，在电磁搅拌器上，于室温下搅拌1小时进行消化。离心(5000r／min)30min，去上清，沉淀加20ml生理盐水，再加等量含10%草酸和0．02%孔雀绿水溶液处理杂菌，37℃水浴中放30min，不时摇振。再离心(5000r／min)30min，去上清，取沉淀物接种培养基上，并制成抹片，抗酸染色后镜检。
若标本为粪便可按下法处理：取粪便(选带粘液处)2g，加生理盐水40ml，摇振使之散开。取粪水4．5ml，加7．5%氯化十六烷基吡啶(Hexadecylpyridinum chloride，Hpc)0．5ml，使药物浓度为0．75%，4℃下过夜。取出弃上清，不用离心，取沉淀物作培养或镜检。
2．分离培养 初代分离培养时，可采用改良Dubos氏培养基。菌种传代可用Waston Reid培养基(固体的和液体的)和改良Herrold培养基。
分离培养时，将处理过的病料接种于改良Dubos培养基上，每份病料接3～5管，接种后，先将试管斜放于37℃恒温箱内几天，然后再立起来，换以软木塞进行培养。每周观察发育情况1～2次。初次分离培养于培养后5～6周可长出菌落。钓取菌落作涂片镜检；可见成丛的抗酸染色阳性(红色)短杆菌。
分离菌的鉴别可将初次分离的培养物，接种一管加有草分支杆菌素的改良Dubos培养基上，另一管不加草分支菌素为对照，培养3～4周，如在前者生长，后者不生长时，初步认为是副结核菌(少数菌有例外，在后者也能轻度生长)。
为了进一步鉴别起见，可试做生长温度鉴别试验，即在W．R．马铃薯上副结核菌于43～44℃下可生长，而牛结核菌及结核分支杆菌不生长；在谷氨酸钠葡萄糖琼脂上，副结核菌不生长，但胞内分支杆菌(此菌在牛体内有时可分出)可以生长，以资鉴别。
3．变态反应诊断 为查清隐性副结核病牛，对已清除结核病的牛群，可用禽结核菌素或副结核菌素(或其PPD)进行变态反应诊断。
除上述诊断方法外，亦可用补体结合反应进行诊断。
结核杆菌培养用培养基有以下几种。
潘曲吉尼(Petragnani)氏培养基的制法如下。
脱脂牛奶 150ml
马铃薯淀粉 6g
蛋白胨 1g
马铃薯(去皮，切成细丝) 75g
全鸡蛋 4个
鸡蛋黄 1个
甘油 12ml
2%孔雀绿水溶液 3ml
将脱脂奶、马铃薯淀粉、蛋白胨与切碎的马铃薯混合，放水浴内煮15min，搅拌成糊状，加热1h灭菌。
冷至50℃，加全蛋、蛋黄、甘油及孔雀绿，摇振混匀，用二层纱布过滤，分装于试管内。斜置血清凝固器内，85～90℃lh，凝固后，间歇灭菌3次，每次30min，每天一次。检后备用。
罗-森(Lowenstein-Jensen)二氏培养基的制法如下。
甲：KH2PO4 0．96g
MgSO47H2O 0．048g
枸橼酸镁 0．12g
天冬素 0．72g
纯甘油(中性) 2．4ml
蒸馏水 120ml
乙：马铃薯粉 6g
丙：新鲜鸡蛋 200ml
丁：1%孔雀绿水溶液 8ml
将甲各成分混合，置沸水中溶解。加马铃薯粉，煮30min，时时搅拌。冷至65℃，加鸡蛋及孔雀绿，搅拌均匀后分装于试管中，放成斜面，放血清凝固器内，灭菌3次。
本培养基适于用4%NaOH处理标本的培养。将KH2PO4改为K2HPO40．54g时，适用于用4%硫酸处理标本的培养。
青霉素血液琼脂的制法如下。
琼脂 1．5g
甘油(中性) 1．0ml
蒸馏水 74ml
兔全血(或牛血) 25ml
青霉素(2000u／ml) 1．85ml
将琼脂粉、甘油及蒸馏水混合，121℃10min灭菌。冷至50℃，无菌加兔血及青霉素，混合，分装，放成斜面，换上灭菌软木塞。
潘曲夫(Petroff)氏培养基的制法如下。
1．取牛肉500g，除去脂肪及结缔组织，置磨肉机中磨碎，加入15%甘油溶液500ml，置冰箱中浸渍一夜，次日取出，纱布过滤并挤出其液体；
2．另取鸡卵十余枚，浸于70%酒精10min以消毒蛋壳，以无菌手术取出其内容，置无菌烧瓶中充分搅匀后用消毒纱布过滤。
3．每100ml牛肉浸出液中加鸡蛋200ml及1%龙胆紫溶液3ml，混匀；
4．分装试管后置蒸气消毒器间歇消毒3日，第1日80℃，第二、第三日75℃，每日半小时。消毒后置37℃二日，取无菌者备用。
此培养基供培养结核杆菌用。
副结核杆菌培养用培养基有如下几种。
改良Dubos培养基的制法。
枸橼酸钠 0．75g
KH2PO4 0．5g
Na2HPO4·12H2 O 3．15g
MgSO4·7H2O 0．3g
胰蛋白胨 1．25g
天冬素 0．15g
丙酮酸钠 2．05g
甘油 11．0ml
Tween80(1%) 25g
琼脂 7．5g
将上述试剂加于400ml蒸馏水中，溶解后，115℃灭菌15min，冷至56℃，加草分支杆菌素10ml，青霉素5万IU，无菌牛血清100ml，充分混匀，分装入试管，放成斜面。培养基的最后pH为7．2。
W-R(Watson-Reid)二氏培养基的制法如下。
天冬素 5g
KH2PO4 2g
MgSO4 1g
葡萄糖 10g
甘油(中性) 48ml
柠檬酸胺 2g
氯化钠 2g
柠檬酸铁铵 0．075g
A液、B液 各 1．33ml
取蒸馏水950ml，分成两份，一瓶内加天冬素，加温溶解。其余试剂逐个加于另一瓶中溶解，两瓶试剂混合后，加甘油及A．B．液。过滤后，分装于烧瓶内，每瓶装100 ml，121℃灭菌20min。
A液： B液：
硫酸锌 2 g 5%氯化钙液
硫酸铜 0．2 g
硝酸钴 0．1 g
蒸馏水 100ml
欲制成固体培养时，按2 %比例加可溶性淀粉，按1．5%加琼脂，高压灭菌后，放成斜面。
W-R二氏马铃薯培养基的制法如下。
将马铃薯洗净，切成有斜面的半圆柱状块，放流水中冲洗24h，再用蒸馏水洗2～3次后，浸于上述W-R液中1～2h。取出装入有颈大试管中，加W-R氏液，使液面与马铃薯保持1．0cm距离，121℃20min灭菌。
改良Herrold氏培养基的制法如下。
蛋白胨 9g
氯化钠 4．5g
琼脂 15．3g
牛肉浸膏 2．7g
蒸馏水 870ml
甘油 27ml
草分支菌素 20ml
加热溶化，冷至60℃，用1mol／LNaOH调pH为7．5。加鸡蛋黄6个，2%孔雀绿水5．1ml，搅匀后分装，放成斜面，使其凝固。于80～85℃凝固器灭菌1h，灭菌两次。
谷氨酸钠葡萄糖琼脂的制法如下。
谷氨酸钠 4．0g
KH2PO4 0．5g
Na2HPO4·7H2O 0．5g
琼脂 20g
蒸馏水 1000ml
上述试剂加温融化后，加葡萄糖10g。用10%KOH调pH至7．0，分装，100℃20min间歇灭菌两次，放成斜面。