生化试验
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第457页（4027字）
一、葡萄糖发酵和精氨酸水解试验
根据代谢糖类——特别是葡萄糖发酵的能力，将霉形体分为发酵性和非发酵性二大类。非发酵性霉形体和少数发酵性霉形体能水解精氨酸释放氨，使培养基pH变碱。
1．材料
(1)试验培养基 牛心消化汤87ml，灭活马血清10ml，试验基质(50%葡萄糖或50%精氨酸)1ml，酚红(1%)0．5ml，醋酸铊(5%)和青霉素(100000IU／ml)各0．25ml，用1MolNaOH将含葡萄糖培养基的pH调至7．6，用1MolHCl将精氨酸培养基的pH调至7．0，分装到带紧塞子的小瓶，每瓶2ml。另用不加试验基质的培养基，同样分装，作为无试验基质对照。
(2)准备pH比色管 调整一组对照培养基的pH，使其从pH6．6至8．0，按pH0．2递增，分装于同样的容器中，封口。
(3)准备对照菌株 发酵葡萄糖：阳性用猪鼻霉形体；阴性用牛生殖道霉形体。水解精氨酸：阳性用精氨酸霉形体；阴性用猪鼻霉形体。
2．方法 用无试验基质的培养基将待测的和对照的霉形体分别作10-3稀释。各接种0．1ml于试验培养基和无基质培养基中作对照。另设未接种的试验培养基对照管。培养后每天观察pH变化，葡萄糖试验管pH下降0．5以上，精氨酸试验管pH上升0．5以上者判定为阳性反应。并与各对照管比较须正确无误。
二、尿素水解试验
尿素酶活性是区分尿原体属与柔膜菌纲中所有其他微生物的重要特性。试验原理：当尿素酶水解尿素释放二氧化碳和氨，使氯化锰形成二氧化锰而沉淀在菌落上或其周围，将菌落染成深棕色。方法：准备含有1%尿素和0．8%二氯化锰(MnCl2．4H2O)的溶液。(此液应当日新配制或贮存于-20℃中)。从琼脂平皿中切取约1cm2，带有疑似尿原体菌落的琼脂块，菌落面向上放在载玻片上，加1至2滴上述溶液，在显微镜下观察，尿原体菌落深棕色，霉形体菌落不着色。
三、洋地黄皂苷敏感性试验
藉本试验，可将柔膜菌纲微生物区分敏感的霉形体科和不敏感的无胆甾原体科。
将被试霉形体接种到液体培养基，生长到对数期，作100至1000倍稀释，使每0．2ml约含105菌落形成单位(CFU，colony formation unit)。取这样的稀释液0．2ml均匀涂布于琼脂平皿，将此平皿开盖置于37℃，至表面水分蒸发无液体为止。用镊子镊取干燥的洋地黄皂苷圆纸片，置平皿中央，并轻压纸片使之与琼脂紧贴。将平皿加盖并将皿盖用胶布或胶纸封住，置37℃下培养(或将平皿置37℃的CO2培养箱中培养)，每日观察一次，有抑菌圈时测圈的宽度。霉形体生长需要固醇，对洋地黄皂苷敏感，纸片周围有5～15mm宽的抑菌圈。绝大多数无胆甾原体属对洋地黄皂苷抑菌作用完全不敏感，可紧挨纸片长出菌落，但其中某些菌株在无血清的琼脂培养基上对洋地黄皂苷较敏感，故进行本试验时，培养基成分要标准化。
洋地黄皂苷圆纸片可自行制备。先备洋地黄皂苷贮存液，即试管中置75mg洋地黄皂苷，加入5ml95%酒精，加试管塞塞紧，摇震使其溶解(必要时加温)，贮于4℃可保存长时。将滤纸轧成直径约6mm的圆纸片，高压灭菌后平铺在灭菌平皿中，每片约吸25μl洋地黄皂苷贮存液，置37℃干燥后，贮存于4℃备用。
四、磷酸酶活性试验
磷酸酶将试验基质二磷酸酚酞水解成为游离酚酞，遇碱成桃红至深红色。方法如下。
1．材料
(1)含有0．01%二磷酸酚酞钠盐的琼脂平皿(免加酚红，加入到培养基中的血清和酵母浸液，在加入前需加热至60℃维持1h，使其中所含的磷酸酶灭活)。
(2)NaOH5M。
(3)待测和对照微生物。阳性对照用关节炎霉形体，阴性对照用精氨酸霉形体。
2．方法 在琼脂平皿上接种0．2ml1∶1000稀释的肉汤培养物，如菌种系固体培养物。则用琼脂块推移法接种。培养7天后检查菌落。在接种和未接种的平皿上各加1ml5M的NaOH；30s以后肉眼检查菌落区，产生桃红至深红色者为磷酸酶阳性反应。
五、膜和点产生试验
某些霉形体接种在含有马血清和卵黄的琼脂培养基上生长时，能在培养基表面产生皱起的珍珠色薄膜(图19-5)；在菌落下面及其周围产生黑色小点(图19-6)。膜由固醇和磷脂构成，点系霉形体分解脂肪酸所释放的钙和镁盐的沉积。
图19-5 猪滑液霉形体使琼脂表面产生皱褶状薄膜
图19-6 猪滑液霉形体产生黑色小点布满菌落表面
1．材料
(1)试验培养基 牛心消化汤90ml；纯化琼脂1．4g，121℃高压蒸气灭菌20min，冷至50℃加入灭活马血清20ml；蛋黄乳剂(1份Oxiod牌浓缩蛋黄液加1份0．9%氯化钠溶液)13．6ml鲜酵母水浸液10ml；DNA(0．2%)1．2ml；醋酸铊(1%)1ml；青霉素(2万IU／ml)0．25ml，分装平皿。
(2)对照微生物：阳性用肺霉形体，阴性用猪鼻霉形体。
2．方法 将试验和对照微生物分别接种至卵黄血清琼脂平皿，在37℃的CO2培养箱中培养2周。每天在显微镜下或肉眼观察。微生物生长良好时，极易产生膜和点。培养期超过二周，某些菌株会出现假阳性结果。
六、四氮唑还原试验
禽败毒霉形体、丝状霉形体等，能还原2，3，5-三苯基氯化四氮唑，使其成为红色甲
；另一些种如猪滑液霉形体则否。
1．材料
(1)四氮唑琼脂 将0．21%2，3，5-三苯基氯化四氮唑无菌水溶液和等量1．3%纯化琼脂混合。
(2)含有待测和对照霉形体菌落的琼脂平皿。阳性对照用牛鼻霉形体。阴性对照用关节炎霉形体。
2．方法 分别倾注4ml四氮唑琼脂至待测和对照霉形体平皿中，置于35℃需氧中培养，经15min后检查平皿的颜色变化，四氮唑还原阳性的菌落呈桃红色，3～4h后逐渐变成深红至紫红色。
七、血细胞吸附试验
禽败毒霉形体、滑液霉形体与红细胞上唾液酸残留物相结合而发生吸附，另一些霉形体吸附机制尚未查明。血细胞吸附试验被用于进行霉形体对动物细胞粘附力(致病性条件之一)的研究。其方法为洗涤豚鼠红细胞，以PBS配成0．5%浓度，吸取2ml红细胞悬液加至有霉形体菌落的平皿中。以菌落单个生长又呈中等大小者(直径0．1～0．15mm)为佳。置于37℃培养30min后轻轻倾去多余的红细胞悬液，用5～10ml PBS小心地洗涤，在100倍放大显微镜下检查红细胞吸附于菌落上的情况。将结果分级如下。
+++-#：红细胞盖住单个菌落表面75～100%的面积。
++：红细胞盖住单个菌落表面50%的面积。
+：红细胞盖住单个菌落表面25%的面积。
—：绝大多数菌落被红细胞覆盖的表面少于1%。
霉形体菌落吸附红细胞活性与培养物日龄及菌落密度有关。某些菌株吸附活性弱，在操作、洗涤时需加注意。特异性抗血清能抑制吸附活性。
八、解朊活性测定
霉形体的蛋白质分解作用，有的用明胶，有的用酪蛋白，此处介绍液化凝固血清法。
1．培养基 高压灭菌了的Hartley氏牛心消化汤(见本章第一节，一．)8ml，无菌马血清30ml，25%酵母膏0．8ml。
2．无菌蒸馏水 1．2ml。将上述各物以无菌手术混和，并以无菌操作将pH滴定到7．8，无菌分装到有螺帽的小试管(10mm×100mm)每管2ml，斜置于流通蒸气灭菌器中成斜面，徐徐加热至蒸气，维持蒸气45min，冷后取出，紧螺帽。
检测时将被检菌液体培养物不稀释，接种两管，稀释成1∶100的接种两管，置37℃培养，每日观察一次，观察14天。融汇生长的斜面部分，可见液化；或出现菌落处，该小点有液化，为液化凝固血清或称解朊活性阳性。
表19-3 畜禽病原性霉形体生化特性的主要区别
*试验中用的红细胞种类各异，一般采用与测试的霉形体来源同种动物的红细胞或豚鼠红细胞。X为未决定。