口蹄疫病毒属
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第670页（4736字）
本属只有口蹄疫病毒一个成员，它有7个血清型，60多个亚型。各主型间无交叉免疫性，亚型间仅有部分或没有交叉免疫性。感染牛、猪、羊、骆驼等偶蹄家畜和鹿、黄羊、豪猪、象等30多种野生动物。人偶尔被感染。主要症状为口腔、蹄部、乳房等部位出现特征性水泡。
口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus)有O、A、C、Asia-1(亚洲1型)、SAT-1(南非1型)、SAT-2型(南非2型)和SAT-3型)7个血清型，其形态结构、理化特性、感染宿主产生的症状均无大差异，但其蛋白质的氨基酸排列顺序显然不同。
表39-2 口蹄疫病毒各种表现形式的性状
一、样品采集
采集有明显症状的数头动物的舌皮(牛)、鼻镜(猪)或蹄部(猪、羊)新鲜未破的水泡皮2g加pH7．6甘油磷酸盐缓冲液(1∶1)10ml保存，或无菌抽取水泡液2ml(不加保存剂)。也可采病后15～30天的患畜血液8～10ml，分离血清，加青霉素1000IU／ml、链霉素1000μg／ml，冷藏速寄国家指定的实验室进行毒型鉴定。
二、病毒分离
(一)细胞培养 病料接种犊牛甲状腺原代或继代细胞，或犊牛、仔猪肾上皮原代细胞较敏感；接种BHK21、IB-RS-2细胞系皆可分离病毒。
1．水泡皮剪碎研磨制成1∶3～6悬液，加青霉素1000IU／ml、链霉素1000μg／ml，-20℃冰冻24h，速融后以3000r／min离心10min，上清液接种细胞或动物。
2．细胞培养长成单层后接种病毒，于37℃吸附60min，加维持液，37℃培养。24h后镜检有无CPE(细胞圆缩，聚集成丛或呈葡萄串状，脱落)。随着传代次数的增多，CPE出现时间也缩短。若无CPE，应于48h取出，盲传数代，有时7-8代后才出现CPE。
(二)动物试验 2～4日龄乳鼠颈背皮下接种0．2ml。也可用3-5日龄乳兔接种1ml；400g以上豚鼠后肢跖部皮内交叉穿刺0．05ml或跖部皮下接种0．2ml。接种后48～96h乳鼠、乳兔出现麻痹症状，最后窒息而死；豚鼠跖部出现水泡。无菌剪去病死乳鼠、乳兔的皮肤、内脏和头足，取胴体为病毒材料；取豚鼠跖部水泡皮为病毒材料。将上述材料剪碎研磨制成悬液如上连续传3～5代后低温保存。若感染动物无症状，应于72h内扑杀，盲传3～5代。
也可用本动物分离病毒，如用2岁内的犊牛舌面接种，30kg体重的断奶仔猪蹄叉接种。接种后2～7天内呈现典型的口蹄疫症状。
三、血清学试验
用于鉴定毒型的方法有补体结合和反向间接血凝试验，后者敏感性较高。用于鉴定抗体型别的方法有正向间接血凝、细胞或乳鼠中和、琼脂扩散和对流免疫电泳等，以前两种敏感性较高。用于进出口检疫的方法有VIA抗原琼脂扩散、正向间接血凝和食道探杯试验。用于口蹄疫病毒污染的肉品、畜产品检测方法有ELISA、核酸探针法、免疫荧光法。用于毒株差异的鉴别及追踪疫源的方法有等电聚焦电泳和RNA寡核苷酸指纹图分析法，这些方法在目前仅处于试验研究阶段。
(一)补体结合试验 按常规方法进行。被检病料悬液离心后取上清液58℃灭活40min，作为抗原，与各型标准抗血清试验，以此鉴定型别。
(二)反向间接血凝试验 用各型标准抗血清的IgG致敏红细胞与被检病料悬液的上清液(加热灭活)作用。如被检抗原在1∶6～1∶48或更高时出现“++”以上的血凝，应判为阳性。试验中应有已知各型抗原作为对照。
(三)乳鼠中和试验 取已知阳性、阴性和被检血清灭活后作1∶5稀释，各取0．5ml分别与等量的1000个LD50各型标准鼠毒混匀，于37℃水浴中孵育60min。分别接种2～4日龄乳鼠，颈背皮下注射0．2ml各4只。每日至少检查4～5次，观察5天，根据乳鼠死亡情况判定结果。例如被检血清+O型鼠毒所接种乳鼠健活，即可判定该血清中存在FMD O型抗体。
(四)细胞中和试验 用适应于细胞培养的各型标准毒株在BHK-21或IB-RS-2细胞培养中检测被检血清中的抗体，同时以已知阳性和阴性血清作为对照。此法可在小瓶中进行，也可用微量法，现将后者叙述如下。
1．在96孔或40孔平底微量滴定板孔内滴加已知细胞毒和被检血清混合液，每孔50ml。
2．每孔滴加营养液配制的细胞悬液(3×106个细胞／ml)50μl，置CO2培养箱内培养2～3天。
3．取出在倒置显微镜下检查CPE后将板浸入含10%福尔马林溶液中固定30min，用水冲洗甩干，再泡入含1%亚甲蓝缸内染色30min，用水清洗甩干，肉眼检查。
4．细胞无CPE被染成蓝色，判为阳性。有CPE的孔不着色为阴性。
(五)琼脂扩散试验
1．称1g琼脂糖加AGB液(甘氨酸15g 巴比妥钠0．52g 迭氮钠0．2g 去离子水加至200ml 用0．2mol／L HCl调pH至8．0)至100ml，121℃高压蒸气10min使其融化。趁热倾入平皿内，厚度3mm，凝固后按图39-1打孔。
2．被检血清0．4ml加等量pH7．6的PBS混匀，再加饱和硫酸铵0．2ml摇匀，室温静置20min，8000r／min离心20min，沉淀物用PBS重悬至0．4ml。
3．中央孔分别滴加O、A、C、Asia-1型浓缩抗原，第1孔加阴性血清(1∶5稀释)，第4孔加与抗原型别相同的标准抗血清(1∶10稀释)，第2、3、5、6孔分别滴加1∶5、1∶10、1∶20和1∶40稀释的被检血清，见图39-1。将平皿放置湿盒内于37℃培养。
4．加样24h后每日检查一次。阳性对照孔应出现清晰的沉淀线，阴性对照孔无沉淀线。滴加被检血清的任何一孔与中央孔之间出现沉淀线者判为阳性，其型别与中央孔抗原型别相同。
(六)对流免疫电泳
1．称琼脂糖1g加电泳缓冲液98ml，10%NaN31ml，121℃高压蒸气融化，趁热倒入7×20×0．3cm的玻璃板上，琼脂厚度为3～4mm。用打孔器打出对称的双排孔，每排8～12个，孔径3～4mm，孔距3mm。
2．各孔分别滴加抗原(浓缩50倍以上)、阴性、阳性血清和1∶5、1∶10、1∶20等稀释的被检血清，室温下电泳90min。
3．取下琼脂板观察，若沉淀线不清，可将琼脂板置湿盒内在37℃静置2～3h再判定。阳性血清孔应与对应抗原之间出现清晰的沉淀线，阴性血清孔则不出现。被检血清任一稀释度与抗原之间出现沉淀线者为阳性，其型别与抗原型别相同。
(七)正向间接血凝试验
1．被检血清56℃水浴中灭活30min，用TPBS液从1∶5开始倍比稀释至1∶640。
2．在96孔V型(底角110°)微量滴定板上的第1～4排第8孔内滴加1∶640被检血清2滴，第7孔内滴加1∶320被检血清2滴……直至第1孔。第9孔滴加阴性血清(1∶20稀释)2滴作为阴性对照，第10孔分别滴加O、A、C、Asia-1型阳性血清(1∶40稀释)作为阳性对照，第11孔滴加TPBS2滴作为空白对照。
3．第1～11孔依次滴加O、A、C、Asia-1型病毒致敏的红细胞诊断液1滴，每型各滴1排，振荡半分钟，室温下静置2h判定。
4．阴性血清孔和空白对照孔无凝集，阳性血清孔发生典型血凝(++++)，被检血清1∶20稀释度以上发生凝集者(++)为阳性。
TPBS配方：0．1mol／L NaH2PO4 115ml，0．1mol／L Na2HPO4385ml，NaCl8．5g，PVP(聚乙烯吡咯烷酮)25mg，Tween-80 0．05ml，NaN31g，犊牛血清5ml，双蒸水加至1000ml。116℃蒸气灭菌20min。
(八)VIA抗原琼脂扩散试验
1．琼脂糖1g，NaN30．2g，Tris2．42g，NaCl8．78g，双蒸水加至100ml。用0．2mol／L HCl调pH至7．6，116℃高压蒸气融化。浇板及打孔规格与琼脂扩散试验同。
2．中央孔滴加VIA抗原30μl，第1孔滴加阳性血清(1∶5稀释)，第4孔滴加阴性血清(1∶5稀释)，第2、3、5、6孔分别加1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释的被检血清，静置于37℃湿盒内。
3．24h开始每日检查一次。判定与前同。第2、3、5、6孔中任一孔出现沉淀线者均可判为阳性。若要定型，再将被检血清用正向间接血凝、琼脂扩散或对流免疫电泳鉴定。
(九)食道探杯试验(Probang test) 此法用于口蹄疫带毒动物的病毒检测。
1．将煮沸消毒10min的探杯(图39-2)自然降温后，趁动物发生吞咽动作时插入食道15cm处，缓慢地上下移动数次后取出，刮取的样品量约为10ml，移至试管中，加等量pH7．0含0．5%水解乳蛋白的Earle′s液，充分摇匀，立即装入冷藏瓶内并加干冰降温，速送指定的实验室检查。
2．样品倒入微型球瓶内，加20%TTE(三氯三氟乙烷)用力振荡，用组织捣碎机以10000～15000r／min搅拌2～3min，充分乳化。移入离心管中4000r／min离心30min上清液接种犊牛甲状腺细胞或IB-RS-2细胞培养4瓶，观察3天，每日检查2次。
3．样品接种的细胞培养出现CPE并用反向间接血凝试验能鉴定出毒型者为阳性，证明该动物隐性带毒。细胞培养1代未出现CPE者，应于接种后72h取出盲传3～4代，仍无CPE出现者判为阴性。