猪瘟酶标记抗体试验操作技术

出处：按学科分类—农业科学 农业出版社《动物检疫手册》第43页（2953字）

(一)溶液的配制

1．0．83%氯化铵溶液(处理红细胞用)。取pH7．40．0125M⁽¹⁾的Tris-HCl缓冲液100毫升，加0．83克氯化铵。溶解后高压灭菌。

2．0．2M磷酸氢二钠溶液(配制PBS用)。称取Na₂HPO₄·12H₂O71．64克，加蒸馏水至1000毫升。

3．0．2M磷酸二氢钠溶液(配制PBS用)。称取Na·H₂-PO₄·2H₂O31．21g，加蒸馏水至1000毫升。

4．pH7．2，0．015MPBS(磷酸缓冲盐水)。取0．2M的Na₂HPO₄溶液72毫升，0．2M的NaH₂PO₄溶液28毫升，加蒸馏水至1300毫升，再按1000毫升溶液加7．6克NaCl的比例，加入NaCl，溶解后即为pH7．2、0．015MPBS。

5．pH8．0，0．0125MTris-HCl缓冲液(配制底物用)。

①0．2MTris溶液：取Tris(三羟甲基氨基甲烷)24．23克，加蒸馏水至1000毫升，溶解后，置4℃冰箱保存备用。20天后应重配。

②0．1N的盐酸溶液：取浓盐酸10毫升，加蒸馏水至1000毫升，置4℃冰箱保存备用，30天后应重配。

取①液25毫升，②液27．5毫升，加蒸馏水至400毫升，即成pH8．0，0．0125MTris－HCl缓冲液。此种工作液如果当天没用完，应放室温下保存，如存放超过2天应重配。

6．含0．01%过氧化氢和0．01%迭氮钠的pH7．2，0．015MPBS(处理内原酶用)。

①1%过氧化氢溶液：取30%的过氧化氢1毫升，加蒸馏水至30毫升，4℃冰箱中保存备用。保存30天后应重配。

②pH7．2，0．015MPBS(配法见上)。

③1%迭氮钠溶液：取1克迭氮钠，加pH7．2，0．015MPBS100毫升，4℃冰箱中保存备用。保存30天后重配。

使用前取上述①液1毫升，②液100毫升，③液1毫升，混合后即为含0．01%过氧化氢和0．01%迭氮钠的PBS液。

7．20%丙酮PBS。取丙酮20毫升，加pH7．2，0．015MPBS至100毫升，4℃冰箱保存备用。保存10天后应重配。

(二)组织触片和白细胞涂片的制作

1．早期检查，用扁桃体触片或白细胞涂片。用扁桃体采样器采取有临床症状的病猪的扁桃体样品，在干净的载玻片上制成触片，或用灭菌针头从病猪颈静脉采取7－8毫升血液装入盛有1毫升3．8%柠檬酸钠溶液的试管内。室温静置一定时间(出现血浆层为止)，吸取上面的血浆层(尽量避免吸取红细胞)，装入试管内，再用干净的玻璃棒粘取适当血浆，在玻片上制成直径1厘米左右的圆形涂片。扁桃体触片或白细胞涂片空干后，立即用4℃丙酮或20%丙酮PBS固定10分钟。干后即可作酶标记试验，或置4℃冰箱中保存备用(时间不得超过2周)。

2．后期检查，用肾脏触片(濒死或死亡猪)。取病料肾(皮质部、髓质部)，去净周围结缔组织和脂肪，割去肾盂部，随后在清洁无油的载玻片上一律制成横切面触片。制作触片时尽量减少组织颗粒留在触痕上，以选用肾切面的第2、3、4个触片为好。触片干后，立即用4℃丙酮或20%丙酮PBS固定10分钟。空干后，即可作酶标记试验，或置4℃冰箱保存(不得超过1周)备用。

(三)染色方法

1．将固定的涂片或触片，浸泡在含有0．01%过氧化氢和0．01%迭氮钠的PBS(pH7．2，0．015M)中，室温放置30分钟，以破坏组织细胞中的过氧化物酶。

2．取出玻片，用PBS洗3－4次，再用蒸馏水洗3次，每次间隔1－2分钟。

3．将洗好的玻片吹干，加猪瘟酶标记抗体(每支加1ml灭菌的pH7．2，0．015MPBS溶解)，标记抗体覆盖的面积应比被检查标本略大些，不宜太薄，加后将玻片置湿盒内，在37℃中反应30分钟。

4．取出玻片，轻轻甩掉玻片上的标记抗体，用PBS将玻片洗6次，每次间隔1－2分钟。

5．将洗好而尚未干燥的玻片，浸泡在底物溶液中，室温放置5－10分钟。底物溶液要现配现用。配法如下。

取pH8．0，0．0125MTris-HCI缓冲液(配法同上)100毫升，加76毫克3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐或3，3-二氨基联苯胺盐酸盐，搅拌溶解后加1%过氧化氢溶液0．5毫升，立即使用。必须注意，在称取联苯胺时，手要洗净，称量纸要清洁，尽量不要沾上酶，以免影响结果。

6．用蒸馏水将玻片洗6次，每次间隔1－2分钟，吹干待检。

(四)检查与判定

1．将染色好的玻片，加上一滴适当稀释的加拿大胶，盖上盖玻片后，先用低倍，后用高倍光学显微镜观察并记录结果。

2．在被检片中，凡出现细胞质染成棕黄色的细胞时，判为阳性反应；若细胞质未染成棕色，则判为阴性反应。

(五)注意事项

1．使用冻干的猪瘟酶标记抗体时，应详细检查安瓶有无破漏，若发现制品有潮解，干缩、变质或加稀释液后不溶时，不得使用。

2．冻干的猪瘟酶标记抗体，置4℃冰箱中保存，有效期为一年。

3．制白细胞涂片时采取的血液不宜放置过久，应在采血后4－5小时以内制成涂片。

4．制触片的肾组织一定要新鲜，冻融过的肾脏组织不宜制作。

5．每支标记抗体启封后没有使用完的，置4℃冰箱保存，只要不污染，在1个月内还可使用。