染料结合法
出处：按学科分类—农业科学 农业出版社《土壤农化分析手册》第573页（2639字）
(一)适用范围 本法简称DBC(Dye Bin ding Capacity)法。是利用蛋白质组成中的碱性氨基酸能与染料(金橙G)结合，而降低染料浓度，进而推算样品对染料的结合量。并由此间接测定种子中蛋白质含量的方法。方法简便，快速，对一些谷类作物的测定，与开氏法有较好的相关性。可用于开发作物品种资源及蛋白质育种筛选工作中大批样品的蛋白质测定工作。
(二)试剂配制及仪器
(1)0．1%金橙G染料溶液：称取20．7g柠檬酸(C6H8O7·H2O)溶于300－400ml温水中，另取1．44克磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)溶于少量水中，将两种溶液倒入1L量瓶中。再准确称取1．000g金橙G(C16H10O7N2S2Na2，分子量452．38)，置小烧杯中，加少量热水溶解，也倒入容量瓶中，滴入10%百里酚酒精溶液3－5滴(防止染料生霉)，然后用水稀释至刻度，摇匀。此即浓度为1mg／ml的染料原液，pH为2．2。
(2)电动谷物磨碎机(8000转／分)。
(3)扭力天平(1／100)。
(4)康氏电动振荡机(240次／分)。
(5)电动离心机(4000转／分)。
(6)G×D－201型蛋白质分析仪(短光径光电比色计)，由北京宣武仪器厂生产。
(三)测定步骤
1．样品染料结合量测定 取约5g样品(小麦、水稻、玉米)置60℃烘箱中烘干，在电动谷物磨碎机中用5s二次的时间磨碎样品〔能全部通过0．25mm筛孔(60目)〕，全部清扫出，混匀，装入小铝盒中备用。测定前将样品放入．65℃恒温箱中过夜(南方湿度变化较大，一律以65℃烘干代替风干样品)。翌晨取出置干燥器中冷却半小时。迅速称取200－700mg(准确至±1mg)置50ml三角瓶中，加入0．1%染料溶液25．00ml塞好瓶口，在水平振荡器上振荡40－60min，使染料溶液与样品充分反应。振荡完毕，将反应后的浑浊液倾入离心管中(应在粗天平上调节每对离心管，使达到等重)，再置入离心机中，以2500－3000转／分的速度，离心8－12min，直至上部溶液澄清为止。用G×D－201型蛋白质分析仪进行比色测定，用482nm波长读取待测液的吸收值A。并以A值从染料工作曲线上查得反应后的剩余染料浓度C。
染料工作曲线的绘制：吸取0．1%染料溶液0，10，30，50，60，70，80ml分别置100ml容量瓶中，用水定容，即得浓度为0，0．1，0．3，0．5，0．6，0．7，0．8mg／ml的系列染料标准液，同样用上述蛋白质分析仪进行比色测定，绘制吸收值A对染料浓度C(mg／ml)的工作曲线。
样品染料结合量(DBC)值的计算：
式中：DBC值——每克样品所结合的染料毫克数；
V——与样品作用的染料液体积(ml)；
C0——染料液原始浓度(1mg／ml)；
C——染料与样品作用后剩余浓度(mg／ml)；
W——样重(g)。
2．制作染料结合量与粗蛋白质的回归方程或曲线 选粗蛋白含量由低到高的与待测样品同一种类的谷物样品30个左右，用开氏法测定其粗蛋白质%；再对这30个样品用上述步骤1，测其染料结合量。以其染料结合量为自变量X，粗蛋白%为因变量Y，配置回归方程：Y=aX+b，或根据a，
，
划出回归曲线。
(四)结果计算
将待测样品的染料结合量DBC值，作为X值，代入回归方程，求得的Y值即为样本粗蛋白质%含量。或直接从回归曲线上查得粗蛋白质%。
(五)注释
①本法测定蛋白质量的原理是利用蛋白质组成中的碱性氨基酸能与金橙G等染料结合。结合量的大小与碱性氨基酸量有良好的相关性。而蛋白质中碱性氨基酸的量是恒定的，故可通过染料结合量大小，求出蛋白质含量。或直接由染料结合量大小来评比同一类作物品种间蛋白质含量的相对高低。
②用本法测定玉米中蛋白质含量时，应把普通玉米和高赖氨酸品种的玉米分开，分别配置各自的回归方程或曲线。因这二种玉米的蛋白质组成中，与测定有关的碱性氨基酸之一——赖氨酸的比例不同。
③测定时每次振荡时间及振速必须一致。振荡前加染料的速度也要快，以免同一批样品前后反应时间不一致。力求每次测定的反应条件一致。
④比色时如无GXD－201型蛋白质分析仪时，可以采用一般光电比色计。但必须将待测染料液稀释50倍，采用0．5cm杯径的比色杯，482nm波长进行比色。
⑤如对大批样品的测定只需了解相对的蛋白质含量高低为目的时，则不必制作回归方程或曲线。而欲用染料结合量来估算样品粗蛋白%时，才需配置回归方程。但配置回归方程所用样品，必须与待测样品同一类型，在同一测定条件下进行。不同谷物样品，应分别配置各自的回归方程或曲线。
⑥也可以不经求DBC值，即直接将样品比色的吸光度与开氏法测得的蛋白质%配置回归方程，计算时，将待测样品的吸光度代入方程，即可计算出蛋白质的百分含量。