染料结合赖氨酸法(DBL法)

出处：按学科分类—农业科学 农业出版社《土壤农化分析手册》第578页（2218字）

(一)适用范围 本法能给出样品中赖氨酸的绝对含量，有较高的准确度与重现性。适用于成批样品分析，不仅可用于谷物品质的育种而且也为食品、饲料等的蛋白质营养评价提供手段。染料结合法原用于测定蛋白质中碱性氨基酸(精氨酸、组氨酸、赖氨酸)量，但在加入掩蔽剂-丙酐酸条件下，丙酐酸能使碱性氨基酸中的赖氨酸的ε－氨基丙酰化，而失去与染料结合能力。因此本法即利用样品与丙酐酸结合前后二项测定的染料结合量之差值，求得赖氨酸量。

(二)试剂配制

1．磷酸盐缓冲溶液 3．40g磷酸二氢钾(KH₂PO₄)，20．0g草酸(H₂C₂O₄·2H₂O)，分别溶于水中，定量地转移到1L容量瓶中，然后加入1．7ml磷酸(H₃PO₄，85%)，60ml冰醋酸和1ml丙酸，用水定容。

2．染料溶液 称取1．363g酸性橙12(Acid Orange 12，分子量350．37)，用磷酸盐缓冲液溶解并稀释至1L。此染料液的浓度为3．89毫摩尔(mmol)，或含染料1．363mg／ml。染料来源不同，纯度不同，故须对染料纯度进行校正。

3．半饱和醋酸钠溶液 取一定量的无水醋酸钠(NaOAc)或醋酸钠(NaOAc·3H₂O)，先配成饱和溶液，再用等体积水稀释为半饱和溶液。

4．丙酸酐(三级)

(三)测定步骤

1．工作曲线的绘制 在样品测定同时，分别吸取3．89mmol染料液28．3，30．9，33．4，36．0，38．6，41．1，43．7，46．3，48．9ml各于100ml容量瓶中，用磷酸盐缓冲液或水定容，即得浓度为1．1，1．2，1．3，1．4，……1．9mmol的染料系列标准液。吸取此系列标准液各20．0ml于30ml的玻璃反应管中，分别加入2．00ml半饱和醋酸钠溶液及0．20ml磷酸缓冲液，充分混匀，在G×D－201型蛋白质分析仪上测定透光率T值。在半对数坐标纸上，以透光率T值为对数纵坐标，染料溶液浓度为直线横坐标，绘制工作曲线。

2．样品测定 称取通过0．25mm孔径(60目)的样品100－1000mg(准确至±1mg，含精氨酸、组氨酸之和约为7．5mg)两份，标为A及B。另取此样品两份(使含精氨酸、组氨酸及赖氨酸之和约为7．5mg)，标为C及D。将样品分别放入30ml玻璃反应管中。向A及B管中加入2．00ml半饱和醋酸钠溶液及0．20ml丙酸酐，向C、D管中加入2．00ml半饱和醋酸钠溶液及0．20ml磷酸缓冲溶液。盖紧盖子，用振荡器振荡10min。取下反应管，向A、B、C、D各管中加入20．00ml3．89mmol染料溶液。盖紧塞子，再在振荡器上振荡进行染料结合反应：一般谷物振荡60min，豆类等蛋白质含量高的样品振荡2－3h，鱼粉等则需6h。反应结束后，取6－10ml浑浊的反应液，注入离心管中，以4000转／min的速度离心10min。取出上清液，用G×D－201蛋白质分析仪测定透光率T值。

(四)结果计算

根据透光率在工作曲线上查出A、B、C、D各管中反应后剩余的染料浓度，分别为CA，C_B，C_c及C_D，取C_A，C_B的平均值为C_A，_B及C_c，C_D的平均值为C_c，_D，按下式计算样品的赖氨酸%。

式中：3．89——染料溶液的初始浓度(mmol)；

W_c，_D——C或D管中未酰化的样品重量(mg)；

W_A，_B——A或B管中酰化的样品重量(mg)；

V——加入染料溶液的体积；

0．1462——赖氨酸的毫摩尔(g)。

(五)注释

①如用一般光电比色计比色时，染料液应用磷酸缓冲液稀释50倍，采用0．5cm比色槽，482nm波长读取吸收值A，用普通方格纸绘制工作曲线。

②染料结合反应是可逆平衡反应。它不仅受pH影响，还受平衡时染料的浓度即样品称量多少的影响。一般应尽量选择称样量使平衡时A、B管与C、D管的染料浓度相近，且使透光率落在工作曲线范围之内。根据一些单位研究推荐的称样量列于表26-5。

③在染料结合反应中染料与样品蛋白质中赖氨酸等碱性氨基酸的反应是等摩尔数结合的。所以用毫摩尔表示的两项(酰化与未酰化)平行测定的染料结合量的差值就是样品中赖氨酸的毫摩尔数，用此值可计算样品的赖氨酸含量%。

表26-5 DBL法的推荐称样量