聚丙烯酰胺凝胶圆柱电泳

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《农作物品种鉴定手册》第112页（7210字）

1．仪器和试剂

(1)仪器

1)电泳仪和圆柱电泳槽(图11－2)。

图11－2 圆柱电泳槽

图11－3 垂直板电泳槽

2)若干小玻璃管，内径为5－6mm，外径为7－8mm，长度约为70－100mm；

3)离心机，每分钟转速约为4000－i6000转和5ml离心管；

4)微量进样器 50－100μl；

5)真空干燥器和真空泵；

6)长针注射器，针头长100mm；

7)研钵或玻璃匀浆器(2ml或5ml)；

8)日光灯20－40W；

9)移液管 25、10、5、2、1和0．5ml；

10)电子天平，精确度达到0．0000g；

11)细长玻璃滴管；

12)小烧杯 50ml和100ml；

13)洗耳球；

14)棕色和白色广口瓶：100、500和1000ml；

15)量筒 10、50、100、250和1000ml；

16)滴瓶60ml。

(2)试剂

1)贮存液和凝胶溶液(表11－1)。

表11－1 贮存液和凝胶溶液的配置⁽¹⁾

2)0．1g溴酚蓝溶于100ml水中，作为前沿指示剂；

3)蛋白质和酶的染色液将在本章11．3．3．3．介绍；

4)保存液7%醋酸(v／v)。

图11－4 水平板电泳槽

2．操作方法

(1)分离胶制

备 剪小块正方形橡皮胶布，将玻璃管一端封住，备用。取贮存液1、2和3号放在室温下平衡，然后将试剂1、2和无离子水，按1∶2∶1的体积比例混合于1只小烧杯中，另取3号试剂4份放于另一只小烧杯中，再取一只小烧杯放入水，并作好标记。把这三只杯放入真空干燥器内抽气10分钟以上，排除气泡，将两杯溶液快速混匀，然后马上用滴管将胶液灌入垂直的各个小玻璃管中，从管底部壁上开始加，避免产生气泡，加至60－70mm高度，立即用注射器加上一薄层经抽气的水，把胶液面覆盖住，注意勿搅动胶面，在室温放置，让其聚合。可看到，在刚加水时，胶和水之间有界面，随聚合而逐渐消失，不久又会出现界面，表明表面凝胶已聚合。

(2)浓缩胶制备 取出贮存试剂4、5和7，室温平衡后，按1∶2∶4比例混合于一烧杯中，另取试剂6号1份放于另一烧杯中，放在真空干燥器里抽气，利用抽气时间移去分离胶面上的覆盖水，再用吸水纸吸干，但注意不要碰到胶面。待抽气完毕，立即将二烧杯液混匀，速将此胶液加到分离胶面上，约10－15mm高度，再小心地加一层覆盖水，然后移到日光(日光灯)下进行光聚合，大约放置10－30分钟，让其完全聚合。待看到胶呈乳白色为止。待胶的聚合完成后，除去覆盖水，并用小滤纸条吸干待用。

(3)安装凝胶玻管 将小玻管下端的橡皮胶布剥去，切勿损坏胶条。在浓缩胶一端套上一小段乳胶管，将玻管安装在圆形电泳槽上。注意安装垂直并应紧密，以防止槽缓冲液漏下。

(4)样品准备和加样(以水稻种子为例) 取各样品种子5－50粒，注要不能取霉烂变质种子，剥去谷壳后切下干胚或取下萌动胚，分别放小型玻璃匀浆器或研钵，各加入20%蔗糖缓冲溶液200－300μl，充分研磨成匀浆，让其静止或离心。然后用微量进样器分别从各样品吸取上清液30－100μ1，分别加在各玻管的胶面上，再加上1滴0．1%溴酚蓝指示剂。

(5)加入电极缓冲液和电泳 分别在上、下槽注入电极缓冲液，上槽淹没小玻管口，下槽满上小玻管下端，检查玻管两头，赶走气泡。

上槽接负极，下槽接正极。然后打开开关通电，起初电流为1mA／管，20分钟后逐渐把电流增加到2mA／管。电泳至溴酚蓝指示剂接近胶底部为止，时间大约为1．5－2．5小时。如已分离良好，可提早结束。

(6)剥下胶柱 先将凝胶玻管从电泳槽上取下，先取1支带长针头注射器，吸满水，将针头从胶管一端小心地插入管壁与凝胶之间，转动玻管，使针头在管壁与凝胶之间螺旋式前进，同时注入蒸馏水，使胶条随水压和润滑作用自行脱出。

(7)染色 不同酶和蛋白质可用不同特异的染色方法。这里仅介绍酯酶的染色方法。酯酶染色液是称取50mg α－醋酸萘酯和50mg β－醋酸萘酯溶于3ml丙酮水(1∶1)中，然后加入100mg坚牢兰B(或R盐)，用0．1M pH6．5磷酸缓冲液稀释到150ml，用于染色。

取出的胶条经蒸馏水漂洗后，放入染色液中，放在25－35℃保温，待酶带呈现桃红色为止。

(8)洗脱和保存 倒去染色液，用蒸馏水漂洗胶条数次，放入5%醋酸脱色至背景清晰，然后用7%醋酸保存。

3．谱带鉴定 根据已知品种的谱带特征，鉴定出所检样品的真伪或区分本品种和异品种，测定品种纯度。

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