体细胞胚胎发生的机理
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第50页（6516字）
体细胞胚胎发生是一种过程，未经配子融合，从单倍体或二倍体体细胞经表征的胚胎发育阶段发育成分化的植株。自然界广泛存在于植物种中，从生殖组织如珠心和助细胞以及体细胞组织，如叶、茎、根等。目前，体细胞胚胎发生已成为人工培养组织培养诱导产生再生的途径，或从愈伤组织，细胞悬浮体，或原生质体培养间接产生，或从有组织结构细胞直接产生，如茎切段尤其是下胚轴或合子胚。
所有产生胚状体的胚原细胞系统，有一个共同特性：很快分裂中的分生组织细胞。包括细胞小、细胞质浓、核大有明显增大的核仁、液泡小和充满淀粉粒。根据它们的组织化学和超显微结构性质推测，RNA合成旺盛和代谢活跃。还有一些问题值得注意，如1．体细胞胚状体来源于单细胞或多细胞；2．启动中的细胞与周围组织的物理性的或生理性的分开；3．与合子胚胎发生是否相似性；和4．诱导进程的相对重要性，外源生长调节剂与组织外植体内在生理状态的失调。
Sharp等(1980)提出如下假说：培养中直接胚胎发生，是从在切取外植体前已决定为胚原发育细胞产生的，即它们是先胚原决定细胞(PEDC)，只要有生长调节剂和适宜条件，使之发生细胞分裂和表达胚胎发生。反之，非直接胚胎发生，需要分化细胞的再决定、愈伤组织增殖和产生胚原决定状态。这些诱导的胚原决定细胞，不仅为了再进行有丝分裂也为了决定胚原状态而需要生长调节剂。Tisserat等(1979)早已得出结论：外植体细胞内部状态，对体细胞胚胎发生表达很重要，其它条件如外源生长物质简单地“许可”这种固有的决定的发育模式的表达。
由于组织外植体一般含有多种细胞类型，外植体的所有细胞是否都有胚胎发生潜势和能力或对再决定发生反应，组织外植体是否所有细胞都有全能性，事实上这种问题尚未能解答，很明显大多数组织培养系统含有可能进行有选择地繁殖的某些细胞类型，例如选择不同倍数性水平，以及大量报道的有赖于培养基的胚原或非胚原愈伤组织的优势生长。
许多系统中，外植体发育时期对体细胞胚胎发生表达是关键，常含有部分分化而不是一致的分生组织。直接体细胞胚胎发生中，这种发育时期专化性，也可视为沿着外植体的成熟性有关的梯级。非直接胚胎发生的组织外植体产生胚原愈伤组织和胚状体较好。但这种状态是否反映着不同细胞类型对再决定的能力的多样性，还是简单的不同组织内特定启动细胞类型的频率不同，尚不明了。就直接体细胞胚胎发生而言，发现这种过程不仅限于某些发育时期，也与特定细胞类型有关。包括胚原细胞，极易成为先决定的胚胎发生细胞和幼年幼苗细胞，尤其是下胚轴表皮。可设想为仍是胚胎发生决定的，或与最低再决定要求密切接近。胚原组织、下胚轴切段和幼表皮细胞具有发育可塑性和易于增殖，胚下胚轴表皮显然是表达体细胞胚胎发生的突出有利材料。珠心和助细胞也有胚胎发生反应。它们虽是特化细胞，是有性生殖中与胚胎发生有正常密切相关联的，类似先胚胎发生决定的细胞。如果设想胚胎发生决定状态与早期发育中细胞类型逐步特殊化相重合，那末可认为像幼苗下胚轴表皮组织，在开始表达特殊化早期状态时，仍保有先决定潜在胚胎发生性质。成熟组织的细胞的特殊化进度是异质的，这将把可见反应阶段扩展到与最低的分化细胞相当Konar等(1972)观察Ranunculus sceleratus再生植株的成熟中下胚轴表皮，发现二种不同细胞类型，胚状体只是从分散在更典型分化表皮细胞中的分生组织小细胞直接产生的。
体细胞胚状体的单或多细胞来源，直接与作为一种胚胎发生群的邻近细胞的协调行为有关。Street等(1974)和Haceius(1978)确认非合子胚是“从一个单细胞产生的新个体，与母体组织无维管束相连接”。但是，Raghavan(1976)和Tisserat等(1979)认为单细胞来源说尚未能证实，许多情况下，明显的两极胚状体是从细胞团块形成的。经愈伤组织或悬浮培养体非直接体细胞胚胎发生，显然广泛形成紧密的胚胎发生细胞团，“原胚原复合体”，由此发育成一到许多胚状体。曾报道过原胚胎发生细胞团是从单细胞发生，进行再决定，继之发生量的分室。胚状体A．可从胚胎发生团或愈伤组织瘤，直接地产生，B．从单细胞产生，通常是表面细胞，C．多细胞出芽或分割，以及一个以上过程产生。
Hacaius(1978)企图协调这些明显不同的观察结果，把原胚胎发生细胞复合体与正常被子植物胚胎发生的胚柄相对应，以及从同一复合体经多细胞出芽形成几个胚状体与多胚发生分割相对应。她也认为还应考虑其它因子。最近Vasil等(1980)提供非直接体细胞胚胎发生的统一方案(图2-1)。
图2-1 非直接体细胞胚胎发生的合成过程
直接体细胞胚胎发生可能是多细胞的，如胚出芽或多胚切割，或胚状体可能从单个表面细胞发生或从这些途径发生。一般言之，多细胞起源的胚状体，在根极或轴区域的广阔区域上与母体组织相融合，而单细胞来源的，很可能与较窄胚柄状器官相连。
从单个细胞分裂开始，胚胎发生为细胞相互关系所控制。如果是单独细胞处于准备分裂状态，它可能独立发挥作用，从单细胞启动点表达潜在胚胎发生，即从合子发育的正常出发点。如果为处于相同诱导状态的邻细胞所包围，这群细胞一起成为一群胚细胞参予胚胎学的进程，如禾谷类典型盾片愈伤组织，“直接”与非直接体细胞胚胎发生的差异变成微不足道了，只对外植体与再生体间有丝分裂周期数降到最低点，具有意义，例如避免体细胞克隆变异。
另一个矛盾是诱导胚胎发生中的细胞离析。诱导胚胎发生是否依靠于消除相邻细胞和组织对胚胎发生—抑制(或分化—诱导)效应?这种观念要求把合子视为胚囊里游离于其它组织之外的。关于设想形态建成阶段改变与邻近细胞间有物理的和生理学的分隔相连系，有几种前提：例如，小孢子发生中，第一次减数分裂前期周围小孢子母细胞出现胼胝质特殊细胞壁，与单倍期发育遗传进程相关连。此外，当羊齿单细胞人为地从周围分化中组织分开时，其决定模式改变，产生新配子体。
Button等(1974)观察到柑桔熟习的胚胎发生的珠心愈伤组织壁厚，无胞间连丝，或有断碎的胞间连丝，围绕着单细胞和小原胚状体。虽不清楚胞间连丝何时断碎，设想发生于单细胞开始分裂之前。但是许多显微镜观察从愈伤组织和悬浮培养体产生的非直接体细胞胚胎发生以及从下胚轴切段产生的直接体细胞胚胎发生结果，未见开始胚胎发生前始前启动细胞的物理性隔离的可作结论的论据。这些细胞显然相互正常连接着(表皮细胞间存在胞间连丝)，直至形成少数细胞原胚。相当于发育极早期胚状体外壁突出加厚，与胞间连丝受损和也可能与角质化有关连，但一般显然是诱导过程的次生产物。
最近研究白车轴草未成熟合子胚发生的初生和次生直接体细胞胚胎发生，未观察到在胚状体启动位置上有细胞壁特化现象，除非包括类似腺质毛状中间结构。发育成这些毛状结构的表面单细胞壁上有胼胝质沉积和角质化。不清楚这些细胞隔离的启动，是否与体细胞胚胎发生或启动表皮毛有联系，在后期表皮毛作为“叉线”参予体细胞胚胎发生。继后研究指出后一解释更有可能。Petu(1970)也观察到胡萝卜启动次生胚状体时细胞壁加厚。
有根据相信正常组织的破损的影响，能以包含在胚胎发生中。如切取外植体培养本身就是正常组织间相互关系的破坏。Sharp等(1980)发现柑桔体细胞胚胎发生的天然化学抑制剂。Wetherell(1984)指出体细胞胚胎发生的加强，与质壁分离严重破坏胞间连丝有关连。此外，合子胚或培养中经体细胞胚胎发生产生的初生体细胞胚状体的增殖，常与生长差或胚原主轴的抑制作用有关连。Haceius(1978)指出活体主胚破损后，胚和胚柄出芽，和成株消失顶端优势等相似现象。
还有可能基于进行着体细胞胚胎发生的细胞生理状态，解决这些矛盾。引导体细胞胚胎发生所需的游离程度，与细胞是否已先决定着胚胎发生，如果不是这样，是否必需在其它非胚胎发生组织邻近发生再决定有关。例如，Wilm等(1983)柑桔珠心合子和Williams等(1984)Rhododenclron有性合子开始发育前积存间隔厚壁。这些细胞要再决定和与相邻组织要有物理性隔离吗?相邻组织退化或进行其它途径?当相邻细胞也先决定于胚胎发生，再不需这种隔离了。非直接体细胞胚胎发生，外植体组织一般至少进行短时间增殖成松散愈伤组织，然后才出现紧密胚胎发生瘤或在悬浮体中发育成原胚复合体。生长素控制的松散性，依赖于壁特性，由此使细胞迅速分开。这种迅速分隔可能包含生长素媒介的诱导的胚胎发生决定细胞的再决定。
一旦发生胚胎发生决定，一组细胞进行整合发育，依赖于抑制部分细胞独立行动的任何倾向。消失这种整合控制，会造成容许胚原细胞或细胞群分布，表达其作为产生潜在新体细胞胚状体之源。同样，不能保持这种控制，可能是胚胎发生(e)愈伤组织的特征，容许继续增殖球形原胚状瘤。整合控制有赖于基因间交流，与胚状体细胞比启动胚胎发生愈伤组织的细胞更为紧密附生着。
Brawley等(1984)和Overa11等强调提出至少直到鱼雷早期极性的决定和保持，可能包含着沿着体细胞胚状体发育轴的稳定离子流。在花粉产生的胚状体中，在建立极性前，可测出这种离心极性现象。增殖中的玉米盾片愈伤组织的球形瘤，也出现明显离心极性，支持这种概念：瘤状胚胎发生愈伤组织不需诱导产生胚胎发生状态，但已是增殖中真原胚团。离子极性减弱和主轴不长，可能是当初生胚轴发育被抑制时，导致出现次生胚胎发生的因子。
荷尔蒙诱导体细胞胚胎发生的作用，它可能与诸因子直接发生互作，包括离心流，控制细胞极性。在BAP存在下，培养自车轴草未成熟有性胚时，从下胚轴表皮直接产生体细胞胚，诱导的最早标记是从有规律垂周壁分裂转变成不规则周缘和斜向分裂。由于BAP不存在时，继续进垂周壁分裂一段时间，BAP效应并不直接影响有丝分裂，而是改变细胞极性和分裂面。
关于体细胞的和合子的胚胎发生是否相似，一般言之，从球形期往后，此二过程形态上相同或很相似。在特定阶段，细胞数或扩展程度可能不同，体细胞胚状体常见畸形或子叶数较多。这些次要差异，一般来自特殊培养条件，启动点相靠近，和多细胞胚出芽。但是体细胞的和合子的胚胎发生早期分室模式可能很不同。大家同意引起形成细胞的分生组织球—球形原胚状体—的分室模式，依靠于这种细胞群建立整合控制和启动形成二极胚的能力。
曾报道胚柄减小或完全不存在，胚状体接着在母体组织的根极的广阔区域，甚至形成可认辨的窄胚柄状接着物，其细胞数相对地较少于同种的正常合子胚胎发生。
非直接体细胞胚胎发生的原胚状体分化常有推迟，和先发生一个原胚复合体的广泛增殖。这类复合体产生的胚状体，其基部与宽大区域相接着。Haccius(1978)认为整个原胚复合体协同成一个胚柄。任何胚胎发生决定的细胞群产生诸胚状体，相当于人工培养的胚柄。这将包括胚生芽例证的胚本身和茎胚胎发生例证中的下胚轴表皮。
无论从愈伤组织培养体非直接产生的或从有组织的组织或单倍体花粉粒直接产生的初生体细胞胚状体，它们显然很易于更多循环的直接体细胞胚胎发生，尤其是从表面细胞和下胚轴区域。从单个表皮细胞或经初生胚状体的多细胞出芽，而产生次生胚状体。其发育常与初生胚状体发育成正常幼苗失败相关联。以及可能反映着细胞从整合控制群逸出。从合子胚直接初生胚胎发生与从初生胚状体直接次生胚胎发生并无根本差别。从已建成可见两极性的胚状体次生胚胎发生与胚胎发生愈伤组织内有离子极性的原胚状体状瘤的继续增殖间也实质上相似。
总之，现已有可能鉴别人工培养观察到多样性相关连的许多共同状态。直接和非直接体细胞胚胎发生间和单细胞和多细胞启动胚状体间有密切统一性。观察到的许多差异，可归结于启动细胞间最相近邻关系的差别，以及细胞是否需要再决定其胚胎发生状态。
一旦细胞决定了它的胚胎发生性能，则采取外植体前先决定的和需要人工培养诱导其胚胎发生状态间，其行为无根本差别。再者，一旦诱导产生了胚胎发生状态，则直接与非直接体细胞胚胎发生间基本相似。原胚增殖组成的瘤状胚胎发生愈伤组织，其中不能保持每群球形细胞的协调行为，与观察到的与抑制主胚轴相关连的直接茎胚胎发生实质上相似。
此外，现已明了单和多细胞增殖不过是代表着相同现象的不同表达。来源于一个到许多相邻细胞是可能的，依赖于它们的内部胚胎发生状态的同步性，以及它们以集团而非个体细胞互作的能力。破坏正常细胞—细胞互作有关因子，如切取组织片段外植体，破坏胞间连丝，细胞壁特殊化，降低细胞间交流等等，可能造成破坏协调的胚胎发生细胞群，导致单个细胞或较小细胞群的进一步增殖。
【参考文献】：
〔1〕Kohlenbach，H．W．1978 Comparative somatic embryogenesis．In：Frontiers of Plant Tissue Culture(T．A．Thorpe，ed．)pp．59—66．
〔2〕Raghavan，V．1976 Experimental embryogenesis in Vascular plants，Academic prees，New York．
〔3〕Sharp，W．R．，Sondahl M．R．，Caldas L．S．，and Maraffa，S．B．1980 The physiology of in vitro asexual embryogenesis．Hortic．Rev．2∶268—310．
〔4〕Street，H．E．1970 Embryogenesis and Chemically Induced Organogenesis．In∶Plant Tissue and Cell Culture：Principles and Applications．(W．R．Sharp，P．O．Larsen，E．F．Paddock．and V．Raghavan，eds)pp．127—153，Ohio Sta．te Univ．Prees，Columbus．
〔5〕Tisserat，B．，Esan，B．B．and Marashige，T．1979 Somatic embryogenesis in angiosperms．Hortic．Rev．1∶1—78．