烟草原生质体游离方法

出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第69页（2078字）

(一)烟草叶肉原生质体的游离

表3-5中列示的若干因素对成功的原生质体释放是至关紧要的。

表3-5 烟草叶肉原生质体游离程序

1．灭菌方法对游离活原生质体是决定性的。当用外植体作为愈伤组织形成起始材料时，长时间的灭菌处理会降低培养物的活力。用于原生质体培养的叶组织灭菌处理应减低到最小限度。作为叶原生质体游离的受体材料，用人工培养苗培养体已有成功的报道。这些苗培养体不需要消毒。

2．表皮细胞对酶处理的抵抗力强，在浸入酶混合液之前，除去表皮是符合需要的，如果降低膨压，叶下表皮是很容易除去的；因此，多数作者在游离原生质体之前，把受体植物放在黑暗中培养12—24h。用刷子擦叶下表面除去下表皮。

3．多数情况下，原生质体酶混合液培育在黑暗或低光强度下。通常叶肉原生质体游离在室温(23—28℃)下和低速振动(30—50次／min)下进行。或用偶而搅拌的静止培养体进行游离。

(二)烟草悬浮培养体的原生质体游离，培养和植株再生的常规程序(表3-6)

表3-6 烟草悬浮培养物原生质体游离和再生

注： 〔1〕酶游离溶液(EIS)含0．7M葡萄糖、3．omM MES，6．0mM CaCl₂·2H₂O和0．7mM NaH₂PO₄·H₂O

本程序成功的若干关键变化有：

1．悬浮培养体原生质体游离常常比叶组织原生质体的游离更困难，这是由于生长在高蔗糖浓度中，细胞的细胞壁增厚。这个问题用仅在对数生长期的极快速生长培养体可降到最低限度。含较高百分率的厚壁的衰老细胞的较老培养物比生长快幼年细胞的细胞壁消化时间要长得很多。

2．原生质体提纯的过滤—离心系统能有效地应用于细胞悬浮培养物。细胞悬浮培养物常常具有较大聚积物。当分离单个原生质体时，它们将机械地分开，而未消化细胞仍保留为聚积物，它不会通过滤器。如上所提到的，反复离心对限制原生质体制剂中的残留酶是必需的。

3．培养原生质体迅速消耗培养基中的葡萄糖，因此葡萄糖的浓度是关键。虽然，这种耗消是与当细胞壁再形成时，对渗透溶液的要求降低成正比例。

4．保持高湿度和慢慢增加光强度，对愈伤组织和随后的苗再生过程是重要的。

【参考文献】：

〔1〕Caboche M．1980 Nutritional requirements of protoplast-derived haploid tabacco cells grown at low cell densities in liquid medium．Planta 149：7-18。

〔2〕Erikason T．1977 Technical advances in protoplast isolation and cultivation．In： Plant Tissue Culture and Its Biotechnical Application(W．Barz，E．Reinhard，and M．H．Zenk，eds．)pp．313-322，Springer-verlag，Berlin．

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〔4〕Kao，K．N．and Michayluk，M．R．1975 Nutritional reguirements for growth of vicia bajastana cells and protoplasts at a very low population density in liquid media，Planta 126：105—110．