应用
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第88页（8766字）
(一)微繁殖
自用培养茎分生组织进行快速繁殖兰花成功以来，近年来对在组织培养技术应用作为重要经济植物无性繁殖可选择方法方面增加了兴趣。在离体无性繁殖技术中提出了“微繁殖”方法，这种培养方法用的外植体极小。在微繁殖中的分生组织培养方面，当目的不是去病毒时，建议选用茎尖和芽的培养。培养中使用大的外植体是有利的，因为它更容易分割，且具有比用小的外植体有更高的存活率和生长率。
1．优点 在几个温带植物种中，用离体微繁殖技术与常规的无性繁殖方法相比较，目前常常更喜欢采用离体微繁殖技术，这是因为微型繁殖可能有下列有利条件：(1)为了在一年中百万倍的再生无性系植株，只需要一小块象最初外植体那样的植物组织，而用常规方法繁殖相等数目的植株时大概需要几年的时间。(2)通常需要大量繁殖很多高抗的植物，离体微繁殖为这些植物提供了一种可供选择的方法。(3)离体技术提供了一种在国际间快速交换植物材料的方法，由于处理严格排除了病毒传入的危险及培养无效果的情况，因而就可以减少或者完全不需要进行检疫。(4)离体培养紫罗兰属植物，经转运或贮藏后，在一年的任何时候都能迅速的增殖。然而，用常规的方法只能在高温的季节才能繁殖。
为了在离体繁殖中达到增殖的目的，可能存在三条途径：(a)提高腋芽增殖的能力；(b)通过器官发生产生不定苗；(c)通过体细胞的胚胎发生产生不定苗。各种繁殖方法有它们的长处和短处，我们将讨论第一种方法的有利条件。
腋芽增殖作为分生组织、茎尖和芽培养中的一种繁殖方法，它的优点表现在试管中已经孕育着分化的早期枝条。然而，对于移植一个完整的植株来说，不仅需要长出枝条，而且还需要分化出根。在离体器官发生和胚胎发生的过程中，很可能经历一些其他方面的生长变化，通常包含愈伤组织的形成以及由愈伤组织分化成小植株，而在大多数植物中，这一点是不容易实现的。归纳起来，腋芽增殖似乎在很多情况下都能适用，如麝香石竹和大豆，而那种器官发生和胚胎发生的方法不能广泛适用。
如果，中间阶段的愈伤组织包含了以下情况：遗传变异的频率增加，特别是有丝分裂的不规则而产生多倍体和非整倍体时，就必须通过器官发生和胚胎发生再生植株。从分生组织、茎尖和芽的培养所得到的植株，其基因型、表现型是同质的，因而培养出来的植株表现了遗传上的稳定性。例如，McCown和Amos(1979)从白桦茎尖培养的微繁殖中，不仅看到了一个肉眼可见的变态枝条，随后还看到了数以百计、千计的再生枝条。发现从分生组织培养再生的所有小植株的绝大多数是二倍体。
尽管小植株繁殖的比率，这里指的是器官建成和胚胎发生的比率是惊人的，连续再培养一定次数之后，它们的再生能力常常迅速降低，最后这个器官发生的潜在能力告终而死亡。另一方面，腋芽培养初期繁殖率缓慢、增殖的比率不高，继续再培养一个周期，最后达到平衡。通过几何级数的增殖比率，估计由单个外植体在个别的年份能够产生并保存百万个植株。这种繁殖的比率对于许多植物种类进行商品化生产来说是可以的。然而，曾经在紫罗兰属植物的繁殖枝条培养中，制定了定期重新培养新的外植体来代替原有的培养体，它象最早的繁殖枝一样能继续适用。
2．简史Georges Morel最早应用茎尖培养作为无性系繁殖的手段，1970年在他的兰花、兰属无性系建立之后，为离体无性系繁殖开拓了前景。在许多从事田间试验的科学工作者中，Murashige认为微繁殖成苗技术有优越性。1974年他发展了在离体培养中生长阶段的概念，第一阶段：外植体成苗；第二阶段：繁殖体增殖；第三阶段：移植于土壤中长根、炼苗。这些概念促使人们认识到在离体培养及再生植株，采用单一的手段通常是不够的。研究者通过一系列专门设计的化学和物理的外界条件进行培养，认为成功的关键与每个生长阶段有关。
使用这种技术的最大成就表现在获得了园艺草本植物。这一成就一方面应归于许多草本植物的顶端优势弱、根的再生能力强，另方面归于财政上资助的温室和苗木培养工作的勤劳。很多作物普遍采用离体培养商品化繁殖，通过腋芽快速繁殖的草本观赏植物的成功例子包括：Anigozanthos、安祖花属、土瓶草属、菊花属、鸭茅属、倒挂金钟属、大丁草属、唐葛蒲属、大岩桐、石头花属、玉簪属、福禄考属和虎耳草属；草本的蔬菜植物包括大蒜、落花生、石刁柏、甜菜、油菜、鹰嘴豆、洋蓟、菜豆、食用火黄和草莓；农学的和其他的草本植物包括：芥、大豆、黑麦草、繁缕、Stevia、豇豆、玉米和苎麻。
与草本植物相比，木本植物的微繁殖是落后的，最大的困难是在第三阶段；移植于土壤中生根及根的吸收困难，特别是从成年乔木上取下的外植体在第三阶段更困难，就是当建立初步培养体时，在第一阶段也经常遇到麻烦。这一方面归究于在很多木本植物的组织中存在大量多酚化合物；另一方面归究于难于打破腋芽生理休眠状态。第二阶段与第一和第三阶段相比，复合枝的诱导是不困难的。
1976年Jones，当他用添加phloglucinol(一种酚类化合物)的培养基时，在离体苹果枝长根方面取得了突破性进展。这一发现促进了当前水果类木本植物微繁殖的兴起。在水果类木本和半木本植物中，通过离体腋芽增殖微繁殖成功的例子包括以下种类：苹果、杏、梨、枇杷、茶藨子属、复盆子和檀香属；木本观赏植物和种子植物包括灰毛滨藜、加拿大黄桦、小果咖啡、银桦属、Kalmia、蔷薇、柳属和绣球菊属(表4-1)。
大多数森林植物用扦插的方法繁殖不容易长根，因而它们的繁殖方法一般是播种，如果用许多经济上重要的森林植物来重新造林，要获得大量的种子是极其困难的。然而，在选择材料重新造林时，可以利用杂交种的杂种优势这个有利条件，但大部分森林植物异花传粉困难，事实上生产杂种的成本也高，在一年生作物中使用的繁殖程序的方式，不能在生长周期长的森林树种中应用，因此，许多选择方案是在自然界的植物群丛或最初杂种世代中，搜寻符合要求的基因型。一旦通过最终选择获得了理想的材料，他们将不得不保持无性系，谁都知道常规无性繁殖方法对繁殖森林树种是有效的。
离体微繁殖中，通过腋芽增殖可以提供实际解决森林树种的无性系繁殖问题，在解决(a)和(b)问题中，少数对外植体来源适用的种子将产生足够的种苗。Whitehead和Giles(1977)估计，从黑杨、云南白杨和杨属的杂种单个芽培养中，每年能产生比106还多的生根小植株．这样的增殖比率对于用小植株重新造林来说：必定是行得通的，因为带有母本植株成熟部分的腋芽外植体对解决问题(c)是困难的，当获得的外植体不是幼年阶段时，对完成微型繁殖的第三阶段即长根是相当困难的。然而，从几种桉属植物的成熟植株100年的老柚木树上取下的外植体，通过茎尖或芽培养的微型繁殖却得到了成功。
对森林树种来说，微型繁殖的实用能力经过了长时间的认识和讨论，虽然在过去的十年期间对繁殖商业上重要的木材种进行过严格的尝试，认为微型繁殖是最好的方法，在这个领域中获得了极其有限的进展。腋芽增殖成功的例子包括下列属中的种：南洋杉属、柳杉属、桉属、杨属、柚木属、崖柏属和擦木属(表4-1)。
表4-1 分生组织、茎尖或芽离体培养以及腋芽快速增殖的植物种类
a．A=Anderson，1975；B5=Gamborg等，1968；BS=广泛培养基，Defossard，1974a；D=Dudits等，1975； GD=Gresshof和Doy，1972；GEW=Gamborg和Eveleigh，1978；HB=Harthey和Borker，1980；IS=Linsmajer和Skoog，1965；M=Miller，1963；MS=Murashing和Skoog，1962；MSB=MS盐+B5维生素；MSN=MS盐+NN维生素；MSW=MS盐+W维生素；MT=Murashige和Tucker，1969；NN=Nitsch和Nitsch，1969；QL=见Nemeth，1981引用；W=Walkey，1972；WH=White，1963；WPM=森林植物培养基(Lloya和McCown，1980)．
b．除指明的以外，培养基组成成份的浓度单位是mg／l。
c．AC=活性炭；NB=营养流体培养基；PG=间苯三酚。
(二)消除病害
当病毒病系感染营养繁殖株时，病原体从一个营养世代传播到下一个营养世代。每年，当同一病原体对很多植物无性系的全部种群感染时，特别是几乎不可觉察的、症状潜伏的病毒感染时，许多作物的品质随每一世代而逐渐降低。当前所有栽培作物的无性系很可能包含一种或更多种病毒病。为了获得最高的产量和质量，种植者希望得到无病毒的植物材料，使用无病毒种薯是一个感人的例子。
Kassanis(1957)和White(1934)证实在无病毒种薯中缺乏常见的病毒微粒或不同低浓度的病毒感染植株的苗端和根端的现象。Morel首先证明了已感染病毒的植株可以通过茎尖分生组织培养恢复成无病毒的植株。人们认识到在消除被感染植株病毒中，化学药剂或物理处理的成功率是有限的。对于从感染苗木中获得无病毒植株来说，人工培养成为唯一有效的方法，也能用人工培养方法从病原体如菌质、和细菌所系统感染的苗木中产生无病原体的植株。对园艺种植业来说，这种方法的重要性是无法估量的。
Wahg和Hu(1980)所汇编的表中，有49种植物经离体培养再生无病毒植株，以下的种也应增添到表中：从非洲东部的木薯培养中消除了非洲木薯花叶病和木薯褐色条纹病；从多花黑麦草培养中消除了黑麦草花叶病；从鸭茅培养中消除了鸭茅条纹病毒、花叶病病毒和斑纹病毒；并且从柑桔、豌豆和白车轴草培养中根除了各种各样的病毒病。Navarro介绍的叫做离体微型嫁接法，是对标准的分生组织培养法作了有趣的改变，已被用来进行柑桔病毒病的脱毒。其步骤是：先把感染病毒幼枝的分生组织顶部切割下来，然后嫁接到离体培养新产生的根茎切口上，继后接口愈合、接穗生长并且根茎长根，整个过程是在无菌条件下进行的。离体微型嫁接也成功地应用于无病毒苹果植株的再生中。
虽然，病毒病经常通过无性繁殖器官从一个世代传播到另一个世代，但是也了解到大约有10%的植物中病毒能通过种子传播而感染宿主植物。如马铃薯种子表皮上带有TMV病毒，又如豆科作物的种子内部也携带有病毒。分生组织培养进一步用来消除种子传播的病毒，已有100多个豌豆繁殖系中，成功地消除了种子传播的花叶病。消除种子传播病毒的成就对遗传材料的国际交流是有帮助的。
(三)种质保存
种质保存是一种保证获得理想遗传材料的有效方法，因为许多生活种子和营养器官的贮存有一定的局限，在种质保纯中调查研究，集中于开发技术以扩展有用的生命时期。对很多作物来说，种子是最适宜保管的形态，由于它的含水量低，细胞能够在低温条件下存活下来。不管用什么方法，更喜欢把茎尖贮存于低温中来保存无性系，因为，分生组织的细胞细胞质浓而无液泡的，预料到经低温保存的活细胞百分率高。此外，分生组织的基因型稳定又很容易再生成完整植株，大量贮存之后，有能力产生无病毒感染的植株。种质保纯中也能从种子传播病毒的植物分生组织中鉴定出极好的材料。
1．冷藏 为了保纯种质使用一种策略，即在最低限度的生长状态下保持培养体，最少量的培养基和低温能使新陈代谢速度缓慢下降。为了避免贮存场地的浪费和减少继代培养的频率，Morel(1975)在9℃下一年仅转移一次，就能保存分生组织顶端存活并再生葡萄小植株。Lundergan和Janick(1979)发现，在离体培养中快速增殖的金黄色芳香苹果的茎尖，可以贮存在1℃或4℃条件下，一年之后生长能力没有丧失。他们估计在普通的0．28m3冷库中可以贮藏大约2000个培养瓶，将供应5．7公顷一定数目苗木的要求。冷冻保存成功地应用于离体培养，由分生组织得到无病毒草莓小植株。他们在4℃黑暗条件下保存的50多个不同的草莓栽培品系达6年以上。Dale(1980)也使用低温来贮存黑麦草属。
在最低温度条件下保持的培养物，并不使细胞进程停止。只是减少培养物转移的次数，每半个月补加一次液体培养基以防干燥，这样做是费力又费时的，培养中也可能遭受微生物的污染。
2．低温保存 在过去5年中，值得注意的是在探究低温条件即在-196℃液态氮的条件下，贮存植物分生组织或营养芽的再生可能性时，发现所有分生组织细胞的新陈代谢活性，在这个温度下很可能是完全被抑制了的，一种可能假设认为，这些分生组织可以无限期地贮存在液态氮中。
Seibert(1976)首先报道了低温保存的麝香石竹枝条的茎尖，Sakai等人(1978)和Kartha等人(1980)报道了低温保存草莓分生组织解冻之后再生成小植株。并在种子繁殖的马铃薯茎尖培养体和分生组织，在-196℃条件下冰冻，并经Grout和Henshaw(1978)和Towill(1981)分别解冻后，观察到作为主要形态学反应是再生成苗丛。豌豆分生组织及耐寒果芽的低温保存也有报道。
很明显，植物组织预先冷冻大大影响了存活率。Seibert和Wetherbee(1977)发现，从麝香石竹植物的供体切下分生组织之前，在4℃条件下冷处理3天或更长的时间，冷冻后的效果导致存活率的倍增，以致再生枝的比率可以增殖到7倍。他们提出增殖的理由是低温能锻炼植物组织耐寒，这些植株在较低的温度时比未经低温锻炼的植株更有生存的能力。刚刚分割的茎尖普遍在寒冷情况下是不能生存的，除非在离体培养条件下预先给予冷冻处理。Grout和Henshaw(1978)首先报道了在一些马铃薯种中生存者对迅速冷冻的要求。在低温保存草莓分生组织中，Kartha等人(1980)发现，当分生组织预先培养在培养基上时，获得了极其大量生存的再生植株(95%)，而不经过冷冻预培养的分生组织，存活率大约只有5%。在豌豆分生组织和马铃薯茎尖中观察到有类似的报道，这种冷冻预培养的有利原因还不清楚。
具有顶端半球形突起及下层带有2—3对叶原基的茎分生组织外植体通常使用低温保存，在冷冻和解冻之后，就这些外植体的状况提出了相反的报告。Seibert和Wetherbee(1977)报道：一般情况下这些不具备叶原基的分生组织细胞冷冻后仍然能保持生活力，而叶原基中的细胞则不能。Grout和Henshaw(1978)也作过类似的报道。相反，Haskins和Kartha(1980)进行EM研究指出，豌豆腋芽和托叶分生组织区域的快速生长的细胞位于叶原基组织，经冰冻处理后能保持生活力，这些相反的结论，可能是由于种或程序上的差异所致。但是，Haskins和Kartha的研究工作指出，原始的分生组织半球形突起不能存活，供冷冻又解冻之后再生完整植株。
在较多的实验中，供试组织只经过液态氮冷冻处理几分钟。实验断定冷冻和解冻是组织生存的关键时期。在液态氮中冷冻时间的长短不应该影响存活率，因为细胞的代谢作用这时可能是完全中止的。然而，Kartha等人(1980)观察到，低温贮存时间从一周延长到两周或两周多直至8周，草莓分生组织的再生率从95%减少到65%以下，Kartha等人(1979)报导，在液态氮中分别贮存1h、一周、七周和二十六周后，外植体中有73%、68%、62．5%和61%再生植株。这些报导指出，一系列贮存时间的研究对深冻贮存是否能表现出确有保纯种质的能力来说是必须的。
(四)生理研究
研究完整植株上的芽，不能不考虑那些影响芽发育的特殊生理因素。切下的芽在离体条件下培养，在其他方面提供一个简单的系统，即不影响与植物其他部分的相关，和不需要的环境因素的影响。这种技术提供着探讨控制芽的生长、休眠、再生周期和其他生理过程的方法。在人工培养中，举出以下这些实例：Altman和Goren(1974)研究了离体培养条件下芽的萌发所需要的时间，观察到柑桔属固有的芽休眠特性。发现离体培养条件下芽的休眠和发芽时间符合大田条件下自然发生的阶段，还认为培养试验可以帮助人们更精确地阐明在芽的生长过程中生长调节剂的作用。在柑桔属夏芽培养中，还发现以下情况：IAA延迟发芽，而GA促使枝条伸长；细胞激动素特别能诱导形成很多不定芽，相反ABA能完全抑制发芽；然而这种抑制是可逆的。1979年，Borkowsko和Powell在芽的离体培养中运用冷冻试验，能够确定苹果芽的休眠状态。
Coleman和Thorpe(1978)在不同高浓度的GA和连续光照下，营养枝顶端离体培养诱导西方红松及Thuja plicate形成小孢子叶球，孢子叶球不能在不足一天GA处理或连续黑暗中诱导形成。小孢子叶球能被GA诱导，而100μM IAA却完全抑制小孢子叶球的产生。尽管在细胞分裂素生物合成中根尖的作用已被确定，一些研究者还认为茎尖可能是细胞分裂素另一个生产场所。1980年Koda和Okazawa通过天门冬属茎尖培养的实验，证实了这种生产方式，发现茎尖培养连续扩散少而恒定数量的细胞分裂素进入培养基中，从再培养开始经贯穿5个阶段中都是没有差异。可是，天门冬属(芦笋)的根尖比茎尖能产生更多的细胞分裂素。
【参考文献】：
〔1〕Andesson，W．C．1980 Mass propagation by tissue culture： prineiples and practics．In： Preceedings Conference on Nursery Production of Fruit Plants Through Tissue Culture-Applications and Feasibility SEA，Agri．Res．Results，N．E．Series No．11，pp．1-1 USDA Beltsville．
〔2〕Kartha，K．K．1981 Meristem culture and cryopreservation-methods and application In： Plant Tissue Culture(T．A．Thorpe ed．)pp．181-211．
〔3〕Murashige，T．1974 Plant propagation through tissue cultures．Annu．Rev．Plant physiol．25∶135-166．
〔4〕Wang，P．J and Hu，C．Y．1980 Regeneration of virus-free plants through in vitro culture．In： Adyances in Biochemieal Enginn ering，Vol．18，Plant Cell Cultures I(A．Fiechter， edpp．61-99．Springer-verlag，Berlin，Heidelberg，New York．