离体诱导单倍体方法
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第113页（9886字）
(一)花药培养
花药培养的技术是相对地简单、快速和有效的。人工培养花药获得了一些植物的单倍体组织或植株(表5-1)。
表5-1 花药和花粉离体培养所获得的单倍体
c=愈伤组织；E=胚；P=植。
花粉发育时期对诱导雄核发育是极其重要的。值得提到一下的是花药的结构和花粉的发育。被子植物的雄蕊由一个花丝、药隔组织和花药组成。在横切面上一个典型的花药呈现两个花药瓣，每瓣具有两个小孢子囊或花粉囊(图5-1)。在成熟时每瓣两个花粉囊是相通的。在幼嫩的花药小孢子发生时，有4个原始造孢组织点，或者功能直接象花粉母细胞(PMCs)或者经历几次持续分裂。PMCs经减数分裂形成四分体。有多种模式，以四面体和等二面体最普遍。由体细胞组织分泌出胼胝质到四分体表面，花粉四分体的胼胝质壁溶解并放出四个小孢子。重新释放的小孢子细胞质浓厚，和一个位于中心的细胞核。当液泡发生时，小孢子体积迅速地增加。于是细胞核被迫朝向边缘移动。在第一次分裂(第一次有丝分裂)时，小孢子核产生一个大的营养核和一个小的生殖核。第二次有丝分裂仅限于生殖核，形成了两个精子，它们不是处在花粉中，就在花粉管中，图5-2A是花粉核分裂的模式图解。小孢子(从里面到外面)被绒毡层、中层、药室内壁和表皮包围着。
图5-1 A．一个雄蕊由花丝、药隔组织和花药组成；
B．一个花药横切面的示意图，表示含有单核小孢子(单倍体细胞)的四个花粉囊
图5-2 小孢子在活体(A)和离体(B、C1、C2)条件下的分裂方式示意图
a=淀粉a=核 nr=雄核 nv=营养核v=液泡
1．花药培养方法 烟草花药是诱导单倍体的理想材料。为了诱导雄核发育，含有第一次有丝分裂的未成熟花药是最适宜的材料。花芽用1%(W／V)Clorox溶液消毒。用无菌蒸馏水冲洗数次，取花药并培养在琼脂固体培养基上。在温室中生长的植株上取花芽时，若细心切取，可不需要再消毒。把花芽的一端切除，轻轻地挤压出雄蕊，收集在无菌培养皿中。通常每管接种5—10个花药。在切除花药时，要特别小心，保证花药不受伤害，丢弃损坏的花药，因为它们常常更趋向从花粉的其它部分产生愈伤组织。
采用MS、White、Nitsch和Nitsch，或及略加修改的不同附加物的基本培养基，但铁是不可缺少的。通常蔗糖的水平是2—4%，可是在禾谷类中较高的蔗糖浓度(8—12%)有利于雄核发育，富含生长调节剂的培养基，促进二倍体组织(药壁、药隔以及花丝)生长，应当避免。在温度24—28℃和用约2000lx光照14h的条件下培养。
花药通常在两周之内开始通过花粉雄核发育，或者烟草大约在6周之内直接发育成单倍体植株，并能够栽到土壤，或者经历增殖形成能够诱导分化成植株的愈伤组织。
幼嫩植株或培养的花药用0．5%的秋水仙素溶液处理24—28h，以得到纯合系。彻底地洗净后，分开栽培。
2．雄核发育的诱导 到目前为止从已建立的花药和花粉培养得到的知识，花粉在单核时，即正好第一次有经分裂前或当有丝分裂时，它对于诱导雄核发育的外界刺激最敏感。不同种植物间形成的小植株差异非常大，例如，烟草大约在胚明显冒出花药前3—5周，而颠茄和水稻要经8周。单倍体植株以两种不同的方式形成，直接由雄核发育(即不经愈伤组织直接由小孢子形成胚)或来自单倍体愈伤组织的器官建成。
现较详细地讨论烟草雄核发育。花药(包括单核花粉)培养，在基本培养基上，2周内转变成微带褐色，没有任何明显的生长标志。培养3—4周后，可见小的白色突起物(胚)，最终发展成小植株。显然，花药基端也能增生，经继续扩大使整个花药布满愈伤组织。它们偶而分化形成小植株。
显微镜观察指出，人工培养花药内的小孢子存在着不同方式发育(图5-2)。小孢子核无论是经正常的有丝分裂形成一个营养核和一个生殖核，或分裂形成两个相似的核(图5-3)。某些花粉营养核，而另一些花粉的两个相似核，经进一步的反复分裂形成多核花粉。生殖核继续保持静止或分裂数次而败育，然而，天仙子中生殖核活跃地进入雄核发育。由于反复分裂的结果，可形成达30个核的花粉，它们是无壁分散的核。这样，这种花药不进入雄核发育，通常都发生败育。
同形成多核花粉相反，小孢子可通过直接分室，直到最后形成40—50个细胞的原胚。胚多在球形期突破花粉粒外壁而被释放。胚经不同时期发育形成近似正常的合子胚。最后，在4—5周内子叶展开，小植株露出花药。因品种、培养基和各种内外因素不同，花药的雄核发育频率和每个花药形成小植株的数量也极不相同。当单倍体植株移栽到培养钵中，能正常地生长发育，但比二倍体植株小。
多核型发育和诱导形成愈伤组织之间，在发育早期不存在差异，可是约二周后，观察到的花粉比多核和胚胎类型更大，且只含有少数几个细胞，这些细胞体积增大，压迫花粉粒外壁使壁裂开，从而以愈伤组织形式释放出来。同时，在某些情况下，由愈伤组织分化成苗。通常来自愈伤组织的小植株是一定符合所需要的，因为它们会表现出不同倍性水平。
在烟草花药超微结构的研究中，得到雄核发育方面的一些有趣的见识。在正常配子体分化后不久，就开始胚胎发生。培养第一天，它们的进程速率相同，但最后配子体过程逐渐停止。在培养7—8天后，胚性花粉营养细胞出现类似溶酶体的多囊泡体。这些囊泡区随培养的时间延长而增大，大约12天后，它们几乎没有内含物。核糖体和其他的细胞器实际上从细胞中消失了。剩下的细胞器主要是质体，聚集在营养核周围。在营养细胞的第一次孢子体分裂之前，线粒体变化小，而配子体细胞质似乎被破坏。在雄核发育期间超微结构的变化好象同观察到的核酸变化模式有关。用RNA和蛋白质的特殊染色法处理胚性花粉，观察到在第一次孢子体的有丝分裂时期，其染色多局限在两个核和核周围一些细胞质上。而静止花粉缺乏可染色的成分。而且第二次有丝分裂花粉，其中每粒的RNA比第一次有丝分裂的RNA更少。
(二)花粉离体培养
虽然已证明花药培养对诱导单倍体十分有效，但花药培养存在的主要问题是：植株不仅来自花粉，然而也来自花药的其它不同部分，结果得到不同倍数性水平的植株群体。花粉人工培养可克服这个困难。还有下列优越性：
①消除了药壁和其它相联系组织不能控制的影响，并能较好地调节支配雄核发育的各种因素。
②可观察到由单个细胞开始雄核发育的全过程。
③由于花粉能均匀地接触化学的和物理的诱变因素，花粉是研究吸收、转化和诱变的理想材料。
④它不象单个愈伤组织细胞那样，花粉能直接转变成胚，因此，对了解雄核发育的物理学和生物化学是最为适宜的。
⑤还能从每个花药获得更多的单倍体植株。
在裸子植物花粉培养上，早期工作证明了花粉分裂的能力。在银杏、柏属和松属上运用花粉培养已获得了单倍体组织。这些实验证明人工培养花粉诱发改变原来形成花粉管和精子的萌发作用。转变其发育方式诱发产生单倍体组织。这项工作扩大到被子植物上，从而获得某些有意义结果。
Kameya和Hinata(1970)运用悬滴法培养甘蓝和甘蓝的离体花粉。他们的方法包括放一滴含有50一80粒花粉的培养基于盖玻片上，然后倒转到一个内陷的载玻片上，并用石蜡密封。它们在含有椰乳培养基上，4周后由离体花粉形成了细胞丛。Later，Sharp(1972)等用“看护培养技术”诱导番茄的离体花粉形成单倍体愈伤组织(图5-3)。
图5-3 番茄离体花粉的看护培养法图解
给植物热冲击能改变花粉核的分裂方式。Nitsch和Norreel(1973a)报道了在第一次有丝分裂时使花粉受损伤，能显着地增加经雄核发育的花粉细胞的数目。
南洋金花花粉在接受低温(4℃、48h)影响后，并把它放在液体培养基中培养。能成功地诱导胚形成。Nitsch和Norreel(1973b)主张把未经雄核发育的花药提取液加入到培养基中，能改进离体花粉雄核发育的效率。在番茄上，也报道用同样方法获得部分成功。后来，Nitsch(1974a)用花药提取液代替完全合成培养基，并从烟草再生出植株。随后，这个工作扩大到其它重要作物上，如烟草、马铃薯、天仙子、南洋金花、木豆和黑麦。
1．离体花粉培养方法
(1)看护培养技术 Sharp等(1972)将离体番茄花粉诱导成了单倍体愈伤组织。其方法是把花药水平地放置在容器内基本培养基上。将滤纸片放置在完整花药的上面，然后，大约10个花粉粒(在悬浮液中)被放置在滤纸片上。对照是把花粉粒直接地放在琼脂上，其他操作完全相同。结果花粉在看护培养上植板效率达到60%，在二周内，滤纸盘上形成了绿色薄壁细胞群。所观察到的这些无性系是单倍体，而对照培养的花粉不生长。后来，Pelletier(1973)在烟草小孢子培养中用矮牵牛属愈伤组织作为看护组织，成功地离体诱导了雄核发育。
(2)预培养方法离体花粉培养技术包括了下列诸步骤，无菌取下花药和进行培养。在27℃下培养4天后，从花药挤出花粉并放到液体培养基中。一升培养基中含有KNO3(8．9mM)，MgSO4·7H2O(0．75mM)，CaCl2(1．42mM)，KH2PO4(0．50mM)，FeEDTA(100mM)，谷氨酰胺(5．5mM)，丝氨酸(0．95mM)，肌醇(0．03M)，玉米素(0．046mM)，吲哚乙酸(0．57μM)和蔗糖(0．06—0．23M)。花粉过滤后离心成片状沉积物。用无菌培养基洗2次，再次离心。以每毫升约5×104个花粉粒的密度悬浮在新鲜培养基中培养。每2ml花粉悬浮液，在小的培养皿或25mi锥形瓶中植板一薄层。可是，如果材料量少，用悬滴培养也能够生长。制备这种培养体，将一滴硅胶放在小的(5cm)无菌塑料培养皿的中央，把盖玻片(22×22mm)轻轻地放在那硅胶滴上。然后吸移花粉悬浮体一滴约250—500μl滴在盖玻片上，为了防止干燥，将培养皿用石蜡膜封闭，培养体放在低光照(500lx)下培养4—6天后，保持在28℃、2000lx日照下，诱导花粉经历正常雄核发育，并最后产生单倍体植株。
最近，这种技术有相当大的改进，从而获得高频率的花粉胚发育，例如，从纯化的黑麦花粉悬浮体分离出能活的小孢子。同样在烟草花粉培养体中诱导了雄核发育，液体培养基中一系列花药培养体能够向培养基中释放出大量的胚胎发生的花粉用于过滤和培养。
花粉培养已取得相当成功。已讨论的随便那一种手段，都可使颠茄离体花粉母细胞和花粉四分体进行反复的核和细胞分裂。被厚的胼胝质壁包住的花粉母细胞，在培养中存在两种类型培养行为，或形成6—8个的小孢子，或者经反复细胞分裂形成一个多细胞类球形胚结构。如果在培养前幼龄花药受低温(4℃，48h)影响，这类球形胚结构的频率增加。假定花粉母细胞早已开始减数分裂，继续胞质分裂产生四分体，并进一步有丝分裂，形成了额外小孢子。可是，假若培养减数分裂前的PMCs，那么或可诱导进行有丝分裂。这种假设必须得到细胞学确认。如果在花药培养中发生这种行为，那么用这种PMCs将产生二倍体植株，这将部分地解释由花药培养得到二倍体植株的来源。
和花粉母细胞一样，颠茄属的花粉四分体在培养中也观察到经细胞分裂形成5—8个正常的小孢子，其中有些小孢子含有2—3个核。即使培养8个月后，还观察到了特殊小孢子，仍是高度细胞质化和有活力的。性母细胞和四分体培养物为花粉个体发育的研究提供了独特的手段。
图5-4 花药和离体花粉培养的雄核发育和单倍体植株形成图解
从烟草属和蔓陀罗属离体花粉的培养工作中，得到的几点重要启示：
①如果离体花粉在培养之前未经淋洗，对其生长和形态建成有不利的影响。未淋洗的花粉或者不能生长或者倾向于形成愈伤组织。
②用冷处理增加雄核发育的频率(图5-5) 冷处理显然抑制纺锤体的形成，并在一些情况下，有时产生不正常的第一次有丝分裂，触发花粉核形成两个相似的核。可是，冷处理花粉的准确检查揭示，也常发生正常的有丝分裂而形成一个营养核和一个生殖核。冷处理不能诱导雄核发育，但是它有助于培养花粉的存活。并且阻止配子体分化，导致较高频率的雄核发育。冷处理的作用是间接的，因此不是离体花粉成功培养的先决条件。
图5-5 低温和离心对Datura花粉胚胎发生的刺激效应
培养第一次分裂之前(A)和之后(B)花芽出现胚性花药百分率，低温处理为3℃下48h，0℃+离心。
③在烟草花粉发育的不同时期，诱导雄核发育的范围，从单核期、第一次有丝分裂期前后到二核后期，但用单核后期到二核期花药成功频率最高。
④增加培养基中蔗糖和肌醇的浓度能够提高雄核发生的频率。
尽管花粉培养技术是在花药培养基础上的改进，培养的花粉象单细胞一样理想，可直接放在瓶中或在悬浮液中培养，而无花药培养的中间步骤。不过这项技术还只得到有限的成功。
2．单倍体原生质体 除去细胞壁和释放出离体植物原生质体已成为一种常规的程序，几乎从植株的各个部分都可游离原生质体。由单倍体植株游离出的叶肉原生体，像由二倍体植株游离的原生质体一样，在培养中容易细胞分裂并再生成植株。但细胞倍数性水平有增加的趋向。烟草、矮牵牛、马铃薯、颠茄和蔓陀罗属的再生植株都能保持单倍体。如果此技术能扩大到许多植物种，叶肉原生质体的培养就能作为单倍体的大规模繁殖的一种方法。
花粉和花粉四分体原生质体的分离已引起许多观点。它们在培养中的行为可能对于花粉个体发育的研究是有益的。特别是原生质体来自及其周围的体细胞组织时，原生质体再生细胞壁的性质是有意义的。显然，从受到细胞壁限制中游离出来的花粉和花粉四分体原生质体能对培养发生反应。
(1)成熟花粉的原生质体 被子植物的花粉粒被孢粉素包着，孢粉素是极坚固的，化学上无活性的和有机物中最有抗性的一种物质。它是类胡萝卜素和类胡萝卜素酯的多聚体，仅被KOH、强氧化溶液和某些有机碱处理所溶解，也被某些微生物溶解。直到现在，尚未知有能消化花粉粉外壁的酶制剂，可是，结合酶法和机械法二种方法能得到少量花粉原生质体。
可用多种方法释放原生质体：如减弱萌发孔，经部分溶解和剥去外壁，以及从花粉管形成亚原生质体。新分离的原生质体呈球形而有液泡。在离心时，它们自发地倾向于融合成多核的大原生质体。在培养中原生质体偶然地出现伸长、分裂和发芽。
(2)花粉母细胞和花粉四分体原生质体在花粉发育早期，即从花粉母细胞和花粉四分体制备原生质体较好。花粉母细胞和四分体被胼胝质壁围住，胼胝质同花粉粒外壁复合物相比，是比较简单的，胼胝质是由不分枝的β-1，3葡萄糖苷组成。花粉母细胞和花粉四分体原生质体的分离和培养程序包括下列步骤：①从幼嫩的花芽中无菌地取出花药；②用醋酸品红染色法查明发育时期；③用小解剖刀切割花药的基端；④用玻璃压挤出内容物。这一步很重要，因为用力过度会压挤出二倍体绒毡层细胞；⑤把花粉母细胞和四分子体浸入酶液，每个花药用1ml酶混合物处理30—45min以上，酶混合物是0．75—1%Helicase的8—10%蔗糖溶液；⑥在培养后，酶混合物小心地用10%的蔗糖溶液取代，原生质体静置；⑦用新鲜的培养基冲洗两次；⑧然后在营养培养基上再次悬浮和培养。可不用离心，因它会进一步减少原生质体的产量。
花粉产生的原生质体，在培养中能再生壁和长出芽，偶然分裂。在它们接触的地方，四分子体原生质体和发育中的小孢子再生共同壁，形成一群细胞或把它称为小孢子组织。目前进行花粉原生质体培养成功的先例有限，由此，诱导单倍体植株的潜力尚待研究。
(三)通过球茎大麦技术丢失染色体
Kasha和Kao(1970)提供的丢失染色体的新方法，对诱导单倍体大麦和大规模生产单倍体植株是十分有效的。这种方法需要大麦(2n=14)同球茎大麦(2n=14)杂交。事实上，杂交10天左右产生种子，然后开始退化。可是，如果传粉后2周解剖出未成熟的胚，培养在无2，4-D的B5培养基上，它们继续生长。由这种胚起源的几乎所有植株都是单倍体(n=7)，而真杂种是罕见的。用杂交和胚培养形成大麦单倍体的方法，如图5-6所示。
图5-6 单倍体大麦形成图解
二倍体大麦和球茎大麦杂交，随后胚培养，一组染色体丢失。
Kasha和Kao(1970)提出的证据表明，这些单倍体不是单性生殖引起的，而是球茎大麦染色体丢失引起的，这种丢失受遗传控制。他们的证据来自下面4个方面：(1)胚内有7条以上染色体的细胞。(2)观察到结籽率比单性生殖诱导的高。(3)当二倍体大麦用四倍体球茎大麦授粉时，结籽率相似于二倍体杂交的。(4)当用大麦作雄株和球茎大麦作雌株时，也得到大麦型单倍体。
普通小麦(2n=6x=42)同球茎大麦(2n=2x=14)杂交，用这种技术也获得单倍体小麦，过程中，球茎大麦的染色体丢失，而获得了单倍体小麦(n=3x=21)。
这项技术代表了大麦单倍体生产上明显进展。它比花药培养有若干优越性。特别是从任何大麦栽培品种都可得到单倍体，花药培养的成功有赖于基因型。用这种方法，产生单倍体的频率很高。另外，获得了非单倍体植株。相反，由花药培养经愈伤组织得到的大麦植株包含有非整倍体。
大麦染色体全部丢失的机制是逐步发生的，这些方法有可能用于其他植物，如马铃薯，由四倍体马铃薯同S．phureja花粉杂交获得双单倍体马铃薯。
(四)孤性生殖的诱导
在自然界，通常通过孤性生殖自然发生单倍体。但是，在某些情况下，也能用人为处理诱导单倍体，特别是运用无活性的花粉或亲缘关系远的花粉。离体诱导孤性生殖是未被开发的另一种途径。尚未试验过离体卵细胞或未受精胚珠的生长。可是，Murgal(1959)企图培养毛叶白花苋的花芽和穗，这是一种无配子体。该植物是雌雄异株植株，在自然界中雄株极少。雌花有5—8个花被裂片，围住一个心皮子房和8—10个退化的雄蕊。培养处在成熟胚囊期的未传粉花和穗状花序能产生40%种子，这些种子偶有萌发。
然而似乎值得考虑的另一种方法是用遗传远缘的花粉进行离体授粉。也可能用培养未授粉子房诱导单倍体的孤性生殖。Hess和Wagner(1974)用这种方法已得到了沟酸浆属单倍体。除去锦花沟酸浆未授粉雌蕊壁(子房壁)，将蓝猪耳的花粉直接放在其胚珠上。用这种方法有1%培养体发生单倍体孤性生殖。
【参考文献】：
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