体细胞杂交技术
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第135页（17794字）
(一)原生质体融合
当用酶法除去细胞壁时，常导致原生质体的自然融合，从而形成多核融合体。这个现象是不奇怪的，看到了胞间连丝连接植物细胞，在某些情况下，扩展而不破裂。已指出这种自然融合产物分裂和形成植株。在某些情况下，多核原生质体诱导形成范围为从南洋金花的8%到烟草的30%。这些种内多核原生质体发生同步分裂。从性细胞分离的原生质体特别容易发生自然融合。性细胞原生质体的自然融合已用于生产麝香百合和Trillium kamtschaticum的种间融合产物。
虽然已建议过几种诱导原生质体融合的方法，最早成功的是用硝酸钠。然而发生融合硝酸钠的浓度对细胞有建议的其他方法有使用盐混合物或葡聚糖硫酸盐培养基中含有Ca++离子的高pH(10．5)能有效地诱导细胞融合。已报告在低速离心混合原生质后达到25%以上的融合频率。
目前最常用的融合方法是向原生质体培养物中加入PEG(聚乙二醇)。这个方法首先是由Kao和Michayluk(1974)报道的。PEG能聚集原生质体。加25—30%高分子量PEG(1540一6000)引起原生质体的聚合作用。当用高pH和高钙离子浓度洗提时，得到了高频率原生质体融合。已报导，在某些情况下，用PEG诱导融合可到100%频率，尚未报道PEG的作用机制。已指出，PEG以一种分子桥起作用，从而离解质膜。也用其他化学药品诱导原生质体融合，如聚乙烯醇。
(二)杂种细胞的鉴定和选择
融合处理后，原生质体在液体培养基中再生细胞壁，并通过有丝分裂，导致亲本细胞的同核融合产物和异核融合产物或杂细胞的混合群体。原生质体融合产物的鉴定和恢复是基于一般观察，杂种细胞显示出隐性突变的遗传互补和体外生长要求的生理学互补(表6-1)。至今，用基于互补筛选可鉴定大多数已重现的体细胞杂种植株。Carlson等(1972)第一次成功地用互补分离出生长素自养的体细胞杂种。在两个烟草种融合后，亲本细胞生长需要生长素，而杂种细胞可在无生长素培养基上生长。生长素自养是两个亲本种的遗传互补结果的表现。
表6-1 用细胞表现型的互补或部分互补找出体细胞杂种细胞或植株a
a．NR=硝酸还原酶；5MT=5甲基色氨酸；AEC=氨乙基半胱氨酸。
Melchers和Labib(1974)首先用遗传互补从烟草的两个独立纯合隐性白化突变体融合后，分离绿色体细胞杂种。这是最常用的分离体细胞杂种的方法。从遗传上隐性白化体分离原生质体群体是同①从第二对非等位基因白化突变体分离的原生质体群融合，或与②正常的叶肉原生质体群融合。例如，Schieder(1977)把用x-射线诱变的两个南洋金花(Al／5a和A7／ls)的二倍纯合白化突变体原生质体融合。用分离的绿色再生苗筛选种内体细胞杂种。同样地，Douglas等(1981)把含叶绿素的黄花烟草原生质体同白化烟草原生质体融合后，分离出绿色的种内杂种苗。
在多数情况下，虽然用二个白化突变体发现体细胞杂种苗是不必要的。当用同形态学特征或生长反应相结合时，单一隐性白化突变体对体细胞杂种植物的分离是很有用的。例如，用能使白化种良好再生和绿色种不能再生的培养基进行筛选。为绿色种不能再生时，全部绿色愈伤组织或苗就是体细胞杂种。用白化突变体结合遗传和生理互补已用于获得蔓陀罗属、胡萝卜属、烟草和矮牵牛属的种间和几个属间的体细胞杂种植物，同时，我们用稍改良的筛选程序发现了烟草属的几个种间体细胞杂种。用半显性白化突变件(Su／Su，烟草)作为亲本，当再生苗时，能独一无二地鉴定原生质体的每个群体。白化原生质体只能产生白化苗，而野生烟草种的叶肉原生质体仅产生深绿色苗。原生质体融合产物是绿色和白化遗传信息的混合物，可用肉眼同亲本苗相区别，因体细胞杂种苗为浅绿色。
在多数情况下，用单个隐性白化突变体作为一个亲本系，对区别从第二个亲本的杂种原生质体是不适当的。所以，用形态学标记结合白化突变体方法，可区别从野生型亲本原生质体产生公认的植物体细胞杂种植株。Dudits等(1977)使白化胡萝卜原生质体与野生型D．capilifolius融合。D．capilifolius和杂种原生质体都能再生，分离的绿苗对区别这两个系是无效的。然而，苗的起源可用杂种植株叶的形态更密切地类似于胡萝卜叶来检测。
建立更有效的筛选方法，或者利用离体产生的突变体对分离更远缘种间和属间杂种是必要的。提议利用二个抗氨基酸类似物突变体和两个缺硝酸还原酶突变体，但是，仍未导致成熟杂种植株的恢复。另外，一些突变体成功地用于恢复体细胞杂种植株。Maliga等(1977)用抗卡那霉素林烟草变异体KR103作为遗传标记找出林烟草和奈特氏烟草之间的融合产物。同样，用从培养细胞分离的抗链霉素烟草突变体SR1用于找到①烟草种内杂种②与林烟草种间杂种和③与奈特氏烟草种间杂种。SR1突变为细胞质DNA的编码，这些体细胞杂种含有表现链霉素抗性的烟草叶绿体DNA，从胡萝卜分离的突变体也用于鉴定体细胞杂种植株。用培养细胞分离出抗放线酮的胡萝卜，当用它与白化系融合，可鉴定出具有抗放线酮性和绿色的体细胞杂种。同样，Kameya等(1981)用胡萝卜的细胞系C123，可鉴定胡萝卜和D．capillifolius的种间杂种，它同时表现抗5MT和抗吖丁啶-2-羧化物(A2C)。杂种细胞筛选是根据对5MT中等抗性和对A2C绝对抗性。
营养缺陷型突变体互补已成功地用于分离Sphaerocor pus和Physcomitrella的体细胞杂种。这个筛选方法仅有限地应用于高等植物。这种限制是由于缺乏高等植物的营养缺陷型。在高等植物体细胞杂种中，只有一份报告是用营养缺陷突变体筛选出来的。Glimelius等(1978)融合了由Muller和Grafe(1978)分离出的两个不同类型的缺硝酸还原酶突变体烟草。二种突变系不能在用硝酸盐作为唯一氮源中生长，而杂种能在硝酸盐培养基上再生成苗。
还未能把原生质体植株再生归之于特殊基因或基因群。苜蓿的证据指出叶外植体再生有一个稳定传递的可选择特性。在某些情况下，已估计有3—4个基因控制培养的叶外植体再生植株。但对融合试验证据未做遗传上分析，可喜的是几乎全部供试细胞杂种都表现原生质体再生行为是显性。在多数杂交试验中，即使两个亲本中只有一个能再生，杂种系也能再生。这些观察，已扩大到允许一些研究者建立一些培养基，它能允许杂种细胞生长，而抑制至少一个亲本细胞系生长。有时，产生的杂种细胞能再生，而两个亲本系都不能再生。例如，Maliga等(1977)用不能再生植株的N．sylvestris的抗卡那霉素系KR103同也不能再生的奈特氏烟草原生质体融合后，产生了种间体细胞杂种植株。
代谢互补也已建议作为一种发现体细胞杂种的方法。这种方法首先是Wright在1978年提出的用于发现一些动物细胞杂种。用不可逆转的生化抑制剂，如吲哚乙酸或二乙基焦碳酸盐处理亲本细胞，经处理后，仅有杂种细胞能发生细胞分裂。用吲哚乙酸处理能帮助发现林烟草和蓝茉莉叶烟草和烟草之间的体细胞杂种。在所有情况下，用吲哚乙酸处理过的亲本原生质体不能再生产，而新形成的杂种原生质体能连续生长和产生杂种植株。
已提议很多筛选体细胞杂种的方法。有时，杂种愈伤组织生长型同亲本系的不同。特别是，一些作者报告杂种愈伤组织常比亲本愈伤组织更有生气。Schieder(1978，1980)指出，所有种间蔓陀罗杂种都比亲本系愈伤组织生长得更好。同样地，根据优势生长进行粉蓝烟草+蓝格斯多夫烟草体细胞杂种的预选。
筛选原生质体融合产物的最有效而烦恼的方法是鉴定细胞杂种和机械分离单个细胞。当用形态上可辨认的细胞进行原生质体融合，能用显微镜观察，明显地从亲本原生质体中鉴别出融合产物。例如，含叶绿素的绿色原生质体与无色细胞培养体原生质体融合后，由于在补充糖的培养基上生长，含有可辨认的淀粉粒，在融合后，能在短期鉴别出融合产物。用PEG处理后，立即在融合产物中可看到一半含叶绿体，另一半含淀粉粒。融合后短时间内叶绿体扩散到全细胞。很多杂种在第一次细胞分裂时，叶绿体集积在核物质的周围。在原生质体培养基上，培养7—10天后，叶绿体表现为无色的前质体。因此，通常叶细胞培养体的杂种细胞仅能在融合后的短时间内加以辨认。同样地，Potry kus(1972)指出，用花瓣原生质体能形象化地鉴定杂种。花瓣十叶融合产物和花瓣+细胞培养体融合产物能容易地辨认。花瓣色素在融合细胞中本来就是分开的，但是终于变成均等分布于融合细胞中。有时，原生质体成分的新混合物产生带特殊颜色的细胞。在转移到原生质体培养基的短期内，花瓣颜色(通常在液泡内)扩散，和叶+细胞培养融合产物一样，仅能用融合后几天里的细胞标记。
肉眼可见标记能用作基于物理学上从亲本原生质体分开融合产物。高国楠(1977)讨论了机械地分离单个异核体的方法。用这个方法，他能分离，然后监测属间和科间细胞杂种的生长。Gleba(1979)改进这种方法，用微分离植物原生质体从而再生出完整植株。Menczel等(1978)结合微分离和看护培养技术，创立了再生植物体细胞杂种植株的程序。在这个方法中，单个微分离异核体放在含有能迅速生长的白化原生质体小滴中。白化原生质体促进单个分开异核体的生长，随后在白化苗中间辨认出再生的绿色苗。然而，微分离方法是很费事的，这些方法提供独特机会，以监视原生质体融合物产生细胞和单个无性系的植株发育。Cocking(1982)提出用显微操作方法各个地挑选原生质融合杂种产物。微分离无疑在将来会得到广泛的应用。
在多数情况下，远缘植物种间杂种细胞不能再生植株。然而，已多次描述过稳定的属间细胞系(表6-2)。随着原生质体融合，产生了大量的遗传产物。融合产物可以是异核体，也可以是同核体。后者招致出现多倍体亲本植株。异核体在核融合前数天内存在。30—45%异核体仅含每个亲本的一个核。虽然，其余部分为多核。多数情况下，多核融合会产生能有丝分裂的巨型细胞并随之发育。然而，曾对多细胞融合物作为获得期望染色体数目更多的体细胞杂种植株的方法发生疑问，例如粉蓝烟草+蓝格斯多夫烟草杂种。最近，已报道烟草和林烟草间的一些体细胞杂种含有96个染色体这些植株是由于一个普通烟草核(48个染色体)与两个林烟草核(2×24个染色体)融合产生的。
表6-2 属间细胞融合产物
异核体的核能够融合而产生杂种，分离产生胞质杂种，或通过异步有丝分裂。Szabados和Dudits(1980)融合了一个分裂间期原生质体种与部分同步分裂中期原生质体第二个种。在产生的双核中，分裂间期核会过早地聚积，导致一些不正常染色体，假若这种现象常规地发生，那么不同细胞周期的细胞融合会导致产生异倍体。已有许多报道，植物细胞杂种中的异倍体和特殊染色体的丢失。高国楠(1977)报告过粉蓝烟草和大豆间杂种中的粉蓝烟草染色体优先丢失。爬山虎属+矮牵牛属细胞杂种丢失了全部矮牵牛染色体，和胡萝卜属+羊角芹属杂种丢失了全部羊角芹属染色体。另一方面，已产生的蚕豆属+矮牵牛属稳定杂种细胞系保留了两个亲本的染色体。
(三)杂种植株的再生方法和特性
任何两个种的原生质体都可融合在一起。然而，高等植物的体细胞杂交广泛利用受到一些限制，包括非整倍体、杂交的种障碍和不可能从原生质体再生成植株等。这些限制强调必须在植物原生质体融合方面进行更为广泛的研究。(1)主要限制是一定要使原生质体恢复再生植株的能力。已报道有几十个属的原生质再生植株。这种限制暂时妨碍了体细胞杂交在大多数重要作物改良上的应用，包括豆科和禾谷类作物。然而，豆类和禾谷类原生质再生的最近进展是鼓舞人心的，表明这种限制不是不可克服的。(2)在大多数体细胞杂种植物(包括种内体细胞杂种)中已观察到染色体的不稳定性。非整倍体杂种植物有性不育，或甚至无产生花的能力，因此不能有性繁殖。未评价过非整倍体对利用体细胞杂交种通过反复回交把有用遗传信息结合到栽培作物中去可能性的影响。(3)成功地产生体细胞杂种的种限制未充分探讨过。应仔细研究种间有性不亲和性同原生质体融合相关，以肯定它对体细胞的不亲和性的限制，即对有性杂种同体细胞杂种在合并和表达有用遗传特性能力方面进行充分的比较。还有，当我们弄清细胞质遗传和我们积累了有用细胞质遗传标记增多，体细胞杂交能用于产生独特的核质组合。于是PEG融合原生质体，能用于转移细胞质控制的雄性不育，或育种选系间其他有用的细胞质特性。
Evans等融合了粉蓝烟草叶肉原生质体和烟草的悬浮培养原生质体。用高的(1976)方法，在三个独立的实验中得到了1—10%的融合频率。当在Kao和Michayluk(1975)的8P培养基上培养原生质体，看到了细胞生长。3周后，把筛选细胞植板到含5μM6BA的固体MS培养基(1962)上。在每个实验中，皆恢复了再现推定杂种的浅绿色苗。2周时，把苗移到长根培养基上，该培养基为含25μM3-氨基吡啶的1／2MS培养基。经驯化的小植株随后移栽到温室。然而选取浅绿色植株来断定植株是体细胞杂种是不充分的，杂交是根据许多标准进行检验的(表6-3)，包括了粉蓝烟草和烟草间的形态的、生化的和细胞的差别。
表6-3 体细胞和有性杂种的特征a
a．体细胞杂种同任一亲本皆在P<0．5上有显着差异。
多数报道，无论是体细胞杂种还是有性杂种的形态特征都介于两个亲本的中间。烟草+粉蓝烟草体细胞杂种的叶和花的形态学特别真实。叶的形状大小、叶柄大小的和毛状体(叶表面的毛)密度在体细胞杂种中全是居中的，另外，花的形状、颜色、大小和结构在这些体细胞杂种也全部是居中的，有性或体细胞杂种的电泳分析常常包含了亲本中的全部同工酶带。用凝胶电泳在烟草+粉蓝烟草体细胞杂种看到了亲本中丙氨酰氨基肽酶的全部酶带，并用等电聚焦看到了部分-I蛋白质小亚单位。在烟草和粉蓝烟草中都看到了酶的不同带，而在体细胞杂种是亲本酶带的总和。天门冬氨酸氨基转移酶是二聚酶，它是亲本酶带的总和，体细胞杂种植株含有粉蓝烟草酶带和烟草酶带之间迁移的唯一杂种带的中间物。这大概表示体细胞杂种形成了唯一的杂种二聚酶。就细胞学而言，体细胞杂种的染色体数目是粉蓝烟草(2n=24)和烟草(2n=48)的总和。统计了25个独立的体细胞杂种系，其染色体数目全部是2n=72(表6-3)。另外，还能区别一些单个的染色体，粉蓝烟草细胞都带大染色体和一对具中间着丝点的染色体，和烟草都带小染色体和9对具中间着丝点的染色体，从体细胞杂种植株中可区别出含有大的和小的染色体，以10对具中间着丝点的染色体，因此，细胞遗传学分析结合酶分析和形态学资料，便可清楚确定原生质体产生的浅绿色植株确是体细胞杂种。
用白化苗筛选方法，Evans等也生产了体细胞杂种植株，即烟草和林烟草，烟草和耳状烟草，这是同烟草有密切关系的两个种，以及烟草和内索非拉烟草，烟草和内索非拉烟草，烟草和斯托克通烟草，这是同烟草不能有性杂交的两个种。抗病性结合到烟草+内索非拉烟草体细胞杂种植株中，证明这些植株在作物改良上是有用的。
已报道的资料表明，其他体细胞杂种的多数特征，都介于两个亲本性状之间，但花粉活力和染色体数目除外，它们分别有减有增。花粉活力常依赖于两个杂交亲本的分类关系：因此，较远缘杂种的花粉活力较低。另外，染色体数目等于两个亲本体细胞染色体数目的总和，但是已报道的资料表明，多数体细胞杂种染色体数目变化较大。多数其他特性，包括营养器官和花特征在内，都介于两个亲本之间。它们包括营养器官如叶形状、叶面积、根形态、茸毛长度、茸毛密度和花特征如花长度、花冠形态、花色素强度、种子朔果形态。在有中间特征的许多列举的体细胞杂种，与已有性杂种良好地比较过。多数形态特征的遗传基础尚未阐明。根据生产的有性和体细胞杂种，居间形态学是查明杂种性最经常引用标准。一些特性，即使行为如同显性单个基因特性一样，它仅在一个亲本中存在，但是也在体细胞杂种中表达。包括茎花青素色素、花色素、中期细胞的异染色质纽和叶大小。未观察到体细胞杂种的所有特征呈居中形态。当可能时，应提供其他遗传数据以支持杂种性(hybridity)。
同工酶分析广泛地用于查明杂种性。体细胞杂种同工酶谱有不同于两个亲本种的独特带型，这些酶包括了酯酶、天门冬氨酸氨基转移酶、淀粉酶和异过氧化物酶。但植物组织内同工酶可存在着极端变化，因此要小心制作和解释酶谱。当比较亲本和体细胞杂种的酶带时，重要的是采用相同组织和相同发育年龄的植株。
已发现有大量种内和种间的体细胞杂种。多数情况下，已产生的种间体细胞杂种作为确定预先筛选系统成功的方法。例如报道了13个成功实验(表6-4)，其中9个全部是同烟草杂交。除9个实验外，另3个种内体细胞杂种是与茄科种杂交产生的，因此，除有一个种是茄科以外的，即用胡萝卜生产的一种种内体细胞杂种。这些报告包括了两个单倍体原生质体首次成功融合得到的杂种植株，首先应用白化体互补和首次使用诱导的自养突变体得到体细胞杂种。在多数情况下，至少，一些杂种植株含有总和染色体数目。一些杂交组合有较大染色体变化(表6-4)，在某些情况下，没有或很少恢复双二倍体植株。未曾强调把这些杂种放在育种计划的位置上。能以期望非正倍体植株表现反常的分离比例。然而，只有两位作者完成后代的详尽分析。已报道后代的分离比例是等于或接近期望的比例。
表6-4 种内体细胞杂种植株
试验许多新筛选方法对鉴定种内杂种细胞的可能性。原质体系(plastome)(P-)，细胞质雄性不育(cms)和核白化基因(例如，wsl，ws2，Su，Al／5a，A7／ls，s，和v)都可用作可筛选标记。如上所述，细胞培养中诱发的许多突变体也试作为可筛选标记，它包括有cnx和nia硝酸还原酶缺乏，抗cycloneximide(CH)，和抗链霉素突变体(SR1)。
表6-5资料中报道了28个成功种间体细胞杂种实验。多数种间体细胞杂种是用茄科种产生的。28份报告中的18份，是用烟草属的11个种植物完成的，18个烟草体细胞杂种中的14个是用普通烟草作为一个亲本系产生的。至今通过原生质体融合有10个不同种烟草曾与普通烟草形成体细胞杂种。除烟草属外，蔓陀罗属有4个，矮牵牛属有3个，茄属有1个，它们都属茄科。仅廿八分之二是茄科以外的植物种间杂交实验。它们都是胡萝卜+D．capillifolius的体细胞杂种。因此，已报告的大量体细胞杂种，除1个例外，这种现象都限于茄科。
表6-5 种间体细胞杂种植株
已报道体细胞杂种植物的染色体数目范围很大。已得到的体细胞杂种多数都是非整倍体。非整倍体妨碍育性。为了最有益的体细胞杂种植株，恢复双二倍体植株是最重要的。在某些情况下，未能取得双倍体植株，而在其他情况下，仅仪取得双倍体植株。例如，carlson等(1972)报道了粉蓝烟草+蓝格斯多夫的成功杂交，就这两个种的有性杂种产生能遗传的(kostoff)瘤来说，这个体细胞杂种大概是不稳定的。事实上，是用瘤特征和生长素自养鉴别这两个种的体细胞杂种系。首次报道的少数植株只有双倍体(2n=36)。第二批植株只有非整倍体(无2n=36)。最后，Chupeau等(1978)检查了大量杂种植株。发现双倍体和非整倍体植株。染色体数目的变化受到下列因素的影响：(1)从融合原生质体再生植株所需要的培养时间长短，(2)组合亲本的核和细胞质基因间的不亲和性。遗憾的是，尚未进行需要区分这两种约束力的关键实验。
多数体细胞杂种植株是不育的，这是不足为奇的，因为已发现这些植株多数是非整倍体植株，因而导致不孕。在两种情况下，因为用cms系作为原生质体的一种来源，而恢复了不育植株。远缘种间杂种比近缘种间杂种的不育性更高。矮牵牛的两个种间杂种是最近缘的两个种间杂交的，它们是可育的。而第三组杂种是不育的。同样，Schieder(1980)报道它们的远缘杂种是不育的，而其近缘杂种则是可育的。在烟草属内比较其育性是更为困难的，因大多数实验是在不同实验中完成的。然而，已注意到在一个实验室中，烟草+林烟草的近缘种间杂种是可育的，而烟草+奈特氏烟草的较远缘杂种是不育的。
(四)杂种植株的变异性
体细胞杂交的杂种植株比有性杂交的植株有更大的变异性。观察了不同植株间表现型的变异性，如株高(21-113cm)、叶形状、叶大小、叶柄长度(0-55．9mm)、花长度、花颜色、花粉生活力(6-74%)、可交配性和同工酶带型。
花粉生活力的可变性对育种计划中的体细胞杂种植株的利用是非常重要的。比较烟草+内索非拉烟草体细胞杂种植株的5个无性系，测得杂种植株生产种子的能力有差别。5个无性系的离体花粉发芽率变动范围为12．2-46．7%。花粉发芽率最高的一个系具有最大的易变性，它能用于同烟草或内索非拉烟草回交。另一个系不能同任何那个亲本进行成功地回交。已知第三个是自花能育的唯一无性系。花粉生活力的可变性决定不同无性系的利用。杂种的变异性是由三种机制引起的；①从长期细胞培养物再生植株之间观察到遗传变异性。特别是在光下长期离体生长的培养物再生的植株能要求得到融合原生质的植株再生是非常可变的。这种变异表现在非整倍体植株上。②某些核结合的不稳定性导致基因表达的丧失，或部分遗传信息的机械损失。如果丧失是有效的，有些变化可在非整倍体中反映出来。③原生质体融合后发生的细胞质或核分离导致细胞质和核遗传信息的独特的结合，其中有些能在表现型上观测出。检查已报道的报告得出的结论是，在再生杂种中观察到的变异性对这三种机制的每一个都有反应。
(五)原生质体融合的程序
1．PEG法 已提出融合两个种原生质体的一些方法。第n组成功的融合产生的体细胞杂种植株是用硝酸钠方法融合的，这个方法不如新近建立的方法更有效。Keller和Melchers(1973)提出，用Ca++离子和高pH值(10．5)处理分离的原生质体。把原生质体混合并放入融合溶液，用低速(50×g)离心，并在37℃下培育30min。钙离子和高pH方法已成功地应用到其他植物。目前应用最流行的方法是Kao和Michayluk(1974)创立的方法。不用低速离心，而用PEG诱导积聚造成物理接触。当稀释钙和高pH时，PEG处理过的原生质体发生融合。PEG洗脱溶液中钙离子浓度比早期报道的方法低。PEG方法已得到广泛的应用，并用于动物细胞杂交，因此代替闻名的但不可靠的仙台病毒诱导融合法。该法也成功地应用于真菌和酵母原生质体融合。该法无特异性，可用于生产种内和种间体细胞杂种。表6-7简示PEG方法的操作程序，已证实有很高的融合频率。表6-6列示用PEG方法完成原生质体融合必需的溶液。原生质体释放后，用酶洗涤液通过离心洗涤除去酶类。PEG融合溶液包括了分子量为1540的PEG。在已发表的报告中，PEG浓度和分子量变化极大。原生质体暴露到PEG(一种有毒化学药品)中后，故必须用含钙离子和高pH(10．5)的PEG洗脱液洗脱。基于高和Michayluk(1974)的PEG融合法的主要程序总结在表6-7中。
表6-6 原生质体融合的溶液
表6-7 原生质体融合的PEG法
融合的原生质体紧贴在盖玻片的表面，因此能在显微镜下监视生长状况。如果两个不同来源的原生质体融合了，如叶肉细胞和细胞培养体原生质体能用肉眼同亲本原生质体相区分。用不同染色法也能区分异核体，原生质体贴到盖玻片上是有用的(表6-8、6-9)，盖玻片可从培养皿中取出，进行原生质体的固定和染色，仍贴附在盖玻片上。然后把盖玻片放在显微镜上检查融合原生质体。已指出可先用荧光探针处理以利检定融合产物。用荧光素和若丹明B配合，能无疑地检定融合产物。荧光至少可持续8h，所以这个方法能用于机械分开融合原生质体。Galbraith和Mauch(1980)也证实荧光标记的原生质仍可再生植株。
表6-8 原生质体融合后异核体的微分离
表6-9 Kao和Michayluk(1975)的8P原生质体培养基
PEG融合法只需稍加修改就能用于各种植物。(1)许多作者认为用分子量为6000的PEG不如用分子量为1540的PEG，在动物细胞融合上，Klebe和Mancuso(1981)试验过7种不同PEG试剂，即分子量为200、400、600、1000、3000、6000和20000的PEG。PEG的适宜分子量是600，其次是1000。200和20，000的PEG对细胞融合无效。(2)PEG的浓度也有变化。已报道用浓度为10-50%PEG是成功的。(3)程序中的第四步是最重要的，已进行过详尽研究。改变除去分离原生质体中的降解酶和PEG聚积之间的时间。适宜的培育时间为5min。经2h培育后，导致融合频率从9%下降到2%。(4)仔细配制和贮藏PEG洗涤溶液也很重要(表6-6)。困难的是遇到这个溶液常发生氢氧化钙沉淀。向PEG溶液中加入豆球朊(con A)能改善PEG方法。许多报道指出加刀豆球朊(con A)能强化PEG诱导的原生质体融合产物粘附。因而，在洗涤融合混合物后保留更多融合产物。这个处理导致小而显着增多的异核体。加二甲基亚砜(DMSO)，也提高融合频率。向PEG溶液中加15%DMSO提高3-13%的融合频率。可以假定，DMSO造成细胞更易受PEG影响，这个处理也对动物细胞融合有效。用20%以上DMSO对细胞生长也无抑制效应。
2．电融合 1986年提出的电穿孔技术，大大地简化了电融合的技术措施。采用电场法融合原生质体分二个步骤：第一步用交流电场(AC)把邻近细胞的膜紧紧地接触在一起，这种过程叫双电泳。第二步采用短时间直流电(DC)冲击，破坏紧靠着的细胞间质膜，经DC(方形波)冲击达到细胞融合。
双电泳作用是把细胞收集在电场内，是用DC场的一般电泳过程相反。在电泳中，只有荷电粒子移动；非电荷的或无净电荷粒子将是静止的。但是，双电泳中粒子可能是正电荷、负电荷或电中性(无净电荷)和仍待供收集的。这是由于电场内的AC性质决定的。就是二极间的粒子受到瞬间改变中电场影响(从几十万到几百万分之一秒)，将诱导粒子产生短暂的二极，因此即使是中性粒子，在AC场内也会产生二极，从而走向最近的电极(图6-1)。
图6-1 在交流电场内细胞的双电泳收集圆圈代表原生质体。
两个电极用竖线截面表示。A-D代表迅速变化(大约500000赫兹)的交流电场诱导原生质体膜中产生瞬间偶极(用+和-表示)的四个“快照”。
植物原生质体，当处于适当频率的AC电场，将形成短暂二极，细胞表面一边是负电荷，另一边是正电荷。这与原生质体是否有无电荷无关。随着AC场极性改变，细胞表面的二极也发生转换。在megahertz(mHz)范围内收集频率为每秒电极改变107次。细胞表面的诱导电荷使得细胞拉到较高电场强区域。由于紧靠电极区电场最强，当接通AC电场时，细胞被移到最靠近的电极。造成这种效果所需AC场的频率和电压视膜成分而定。植物原生质体，用场强150-250v／cm和500kHz，在10s以内，就能把细胞收集在电极上。随着细胞接近电极，它们趋于形成细胞链，由于细胞导电力比培养基的较高，使得细胞的极变成局部较高的电场。“珍珠链”形成，使邻近细胞的膜密切相靠，产生了继后融合步骤的先决条件。
一经细胞排成队，采用足量电压短时间DC冲击，使膜破碎，达成融合。在DC冲击时，首先在邻近细胞接着点开始细胞膜破碎。诚如双电泳一样，这是由于细胞内部电导力，使得大部分电流通过细胞而不是培养基流动。可见细胞是较好导电体，与周围培养基相比较的话。由于膜在细胞接着点破碎，DC冲击产生细胞融合而不是胞溶(图6-2)。DC形状和冲击时间是关键。融合冲击必须是方形波，升高和下降时间短于2μs。植物原生质体融合用10-50μs。融合所必需的DC电压视电极间距离和融合室内细胞密度而定。一般长时间冲击(＞i00μs)和超适电压将导致细胞胞溶(表6-10)。
图6-2 电诱导膜破裂导致细胞融合
图示电融合时，发生的分子行动模式。
A．在双向电泳过程中，使相邻质膜靠近，密切相接触；B．用单次高强DC脉冲使胞间联丝破裂(仅在细胞的二极)；C．融合脉冲后，质膜修复。如果二个相邻细胞，在膜破裂时，密切靠近，脂质恢复完整双层膜，使二个细胞融合在一起。
表6-10 电刺激原生质体融合
a．参考文献
1．Bates等1983，
2．Gaynor(未发表资料)
3．zimmermann1982，
b．脂质体，平均直径5-10um单层脂质小胞，由卵磷脂组成。
电融合的基本设计。植物原生质体融合要有二种不同信号发生器，与融合室平行联接(图6-3)。用于双电泳收集的AC场，由波形发生器发生，例如，可用Hewlett-Packard发振器(型号200CD)。它产生正弦波AC信号0-100V，频率为几百万Hz(每秒循环次数)。第二信号要用方形冲击发生器，可采用Gruss Medical Instruments(Quincy，M．A．)刺冲型号54。发生DC方形冲击1-200μs电压为0-至少150V。还必需产生很准时方形波冲击，升和衰时间<2μs。用示波器以便校正电系统的状态和定量冲击频率、时间、场强等等。
图6-3 电融合仪器设置概图
融合室设计。简便有效的融合室设计，是用载玻片为电极载器，在其上平铺抗氧化电导体(金、铂-铱、银丝等)，应保证电极表面是高度平滑光洁的。以直径0．5mm镀金铜丝较好。电极间距离200-500μm，尽可能排成平行，盖薄盖玻片，胶合在融合室上，二端接着薄聚乙烯管(直径0．3mm)。诸管端用清洁硅橡胶密封。Watts等(1984)设计了Zimmermann等(1981)原设计简化电融合微室，其结构用可移动的电极板放在标准培养皿内，在20s内可使1ml培养体发生电融合。其特点是：在远离电极处细胞凝集和融合；设置简单而节省；能容纳原生质体悬浮体达1ml每20s；原则上能处理单对原生质体。
Watts设计和自制的可移动电极片模具体装置见图6-1。用直径3cm可随意处置的塑料培养皿作为固定的电极室。电极用薄铜丝(22SWG)制成，电极间距离3-7mm，铜丝横向伸展在器皿板上，铜丝间距离1-3mm，二极穿过壁孔固定，弯向器皿顶边，壁孔、铜丝间间隔处和器皿板用石蜡封牢，以防培养液流失。用吸移管吸取原生质体悬浮液0．1-0．3ml，注入电极间的空间，经表面张力而固着。由此全部原生质体都经受着电场的影响。
融合培养体的可移动电极设计，由五片L形铜填隙基片，厚0．25mm，短边长2cm，为丙烯片分隔开，厚0．46cm，粘合在一起，形成边长2cm的正方柱。在交替金属片上通电，形成各为2和3片的两个电极，电极间距离为0．3cm。电极可用乙醇消毒，供无菌培养用。采用这样的装置，组成10cm2的25室培养皿的2cm2的组织培养井。
采用这种装置，并经试验结果选出了运转的最适条件：固着0．3ml原生质体悬浮体，AC场10VRMS，0．5MH3，15-20s，随之用250-300DC脉冲。取得满意结果。用烟草cv．Xanthi和蓝茉莉花烟草叶原生质体试验结果，指出无甘露糖醇溶液会使原生质体暴露而不是融合，为此在电融合混合培养基中加0．1-0．5mMCaCl2，可以消除这种破坏现象。DC脉冲电压以400-500V／cm为宜。脉冲时间受电容器大小(8μF)和系列电阻(100-200chms)的控制，时间常数(R．C)约1ms。时间较高会引起原生质体暴破而不是融合。原生质体密度以2-8×104／ml，有利于原生质体相互吸引和形成团块，并以二体融合(双核体)占优势。实验结果以电极间加较低密度4×104／ml原生质体，细胞团块少，融合产物几乎完全是双核体。原生质体制备和RF场处理时间长短都有明显影响。
Watts法与Zimmermann法相比较，其优点在于：处理的原生质体容积较大(1ml比20μl)，DC脉冲时间长(R．C1 ms比20-40μs)，易于掌握。AC场强较弱(20v RMS／cm比200v／cm)而一致(一致比不一致)，效果不同。Watts的原生质体自由分布，受AC场影响后产生的二级原生质体沿着场线相互移动，而不是向电极沿场线排成珍珠链，也不接触在电极上，可见融合不必要接触电极才能启动。DC脉冲可通过培养液传给原生质体，避免了融合产物难于从电极卸下问题。原生质体大都成对融合而不是成堆融合(2比多达40核以上)。就是说双电泳对形成细胞团块并不起作用，而是相互吸引导致移动。这种互作效应，高密度原生质体时更为明显。由此可以期望在同一或相近场线上的原生质体间距离较小(100-200μm)的成对原生质体优先移动。很快融合。能在DC脉冲后5min内完成。融合后3到24h进行核和细胞质组织化。
Saunders等(1986)研究AC和DC脉冲对原生质体生存率影响。显微镜观察结果，原生质体在AC电场作用下发生的反应，在特定电流频率下，细胞移动，包括非球形细胞的定位，形成珍珠链，轮转，变形，和细胞融合。每一步骤各有其适宜频率。且因植物种类、外植体类型和生理状态等而异。必需在研究中肯定。如Tempelaar等(1985)发现Solanum brevidens叶肉原生质体受AC场动力排队速度，比黄花烟草细胞悬浮体原生质体为快。在各步骤间有相互关系，如原生质体在AC电场内轮转是其诱导排队的动力(Zimmermann法中的状态，Watts法并无此需要)，但轮转中原生质体不能融合，必需调节电流频率(强)加以控制。例如烟草原生质体在频率5-300kHz下轮转，是否与DC脉冲配合，均对细胞生存力无影响，但频率过高会引起胞溶而非融合，DC脉冲的强和时间，也是融合或胞溶的关键。应经试验测定其最适条件，方能达到目的。此外原生质体培养液不加甘露糖醇时，易于暴破，可用完全培养液洗原生质体或在电融混合液中加0．1-0．5mMCaCl2，可消除融合期间原生质体破碎，改进融合效率。
最近报道证实了电融合是形成有生活力植物杂种的有希望技术，尤其是用化学技术难于取得融合成功的种。当前仍需加强研究细胞融合频率，生存率，和融合后杂种细胞培养，经用多种植物为供试材料，进行数量研究，以利总结成基本(标准)技术的理论基础，供扩大应用。
植物原生质体膜的磷脂对调节融合频率是重要的。因此，看到温度变化能影响磷脂浓度，从而改变了原生质体融合的频率。Nagata等(1979)已查出合成磷脂能诱导原生质体融合。认为它对研究原生质体融合的机制是有用的。
也观察到其他化学药品促进细胞融合。Nagata(1978)把15%聚乙烯醇(PVA)溶液与0．05M CaCl2和0．3M甘露醇组合在一起，用于融合植物细胞。PVA是一种非离子表面活化剂，在2%以上的PVA中对细胞生长无害，可采用不同分子量的PVA。Nagata(1978)指出为了融合，PVA500比PVA1400或PVA200都更可取。葡聚糖硫酸盐也用于诱导原生质体融合，这个化学药品被限制使用，因为它对植物细胞有毒性。Klebe和Mancuso(1981)试验了118种化合物，全部都意味着膜活动作用，发现有20种以上化合物有作用，促进动物细胞融合，与用PEG有近于同样效果。也已知能积集原生质体，但大多数这类化合物尚未作为融合剂。已建议用于原生质体融合的一些其他处理。其中，最引人注意的是电刺激。Senda等(1979)发现2支玻璃毛细管微电机能用于融合粘着原生质体。微电极与原生质体接触，和几毫秒的5-12毫安的改变对诱导融合是有效的。同样地，高强度电场用于融合植物原生质体。甚至建议植物病毒如马铃薯黄矮病毒有细胞融合的能力。
有几种方法用于从杂种和亲本原生质体混合物中分开体细胞杂种原生质体。细胞分类法改变了复杂性和有效性。Galbraith和Mauch(1980)指出用细胞分类分开不同标记的原生质体，但是，昂贵装置阻止了它的广泛应用，Harms和Potrykus(1978)用等渗密度梯度分开融合产物。在KMC(钾-锰-钙)蔗糖密度梯度中，用50-100×g离心原生质体混合物2-4min，能使异核体增多。细胞分离最可靠的方法是微分离，但应用于原生质体尚远。表6-8列示了根据高(1977)关于粉蓝烟草叶肉原生质体和大豆(SB-1)培养细胞原生质体间的异核体研究的一个简单程序。异核体易于同亲本原生质体分辨，因它含有绿色质体和细胞质束。微分离过程受到39%高频率异核体的帮助。重要的是使用能维持单个稀释异核体生长的原生质体培养基。
Kao和Michayluk(1975)创立的原生质体培养基列示在表6-9中，然而这个培养基可能有不必要的成份，这适用于低密度原生质体和细胞培养。Gleba(1978)建议一种改进微分离方法，从很小体积培养异核体，因而导致一种每毫升2-4×103细胞的有效密度。已指出这个方法导致很高植板效率。
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