培养要求
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第158页（11219字）
(一)表面消毒
种子植物的胚寄存于胚珠内，外被子房。由于它们包裹在无菌环境内，不需要直接消毒胚表面，除非种壳破碎，或已知病原菌存在于种壳内部。而整个胚珠、种子或果实要表面消毒，从其周围组织无菌条件下取胚。一般用于植物组织的表面消毒方法也适用于胚、种子和果实表面消毒。由于胚的周围组织是不要的，消毒方法可相对粗放。次氯酸钠含有商品洗涤漂白作用，如clorox，乙醇是最适用的消毒剂。为了增高组织的受湿性，常加表面活化剂(0．01-0．1%)，如吐温20，吐温80，Teepol，Mannoxol或其它洗涤去垢剂。磁力搅动、超声波、或真空器适用于浸入消毒剂的植物材料，以减少残留在材料表面的气泡。举例示之。作者常用10%(v／v)clorox(0．45%次氯酸钙)消毒小坚果(新从冬青和檫树属核果取出的)Dunwell(1981)用5%(v／v)次氯酸钠消毒大麦颖果15min。Monnier(1982)把菜豆属成熟豆粒浸入60g／L次氯酸钠10min。用70%乙醇消毒百合属未成熟杂种蒴果(Asano1982)和Tris成熟种子(用95%乙醇)。Khuspe等(1980)表面消毒番木瓜×加利福尼亚番木瓜幼杂种种子，最初用70%乙醇5min，然后放入20%氯水15min。乙醇除有消毒能力，也有作为表面活化剂功能。例如大豆类表面，带有一层浓毛茸，有保留气泡倾向，增加消毒困难。为此可将荚浸入75%乙醇，再放入．Clorox溶液。消毒后常用无菌蒸馏水洗胚珠、种子或果实表面几次。
硬壳种子如冬青属和仙客来属先浸水几小时到几天，使之易于解剖。可在浸水前或后进行表面消毒。
当种子内部带菌，或切取时胚受污染。有必要再进行离体胚消毒。Dahmen等(1971)把玉米种子和离体胚先浸入70%乙醇，加2．6%次氯酸钠5min最有效。Schaeffer等(1984)推荐用10%商品漂白粉(约0．45%次氯酸钠)处理小麦离体胚1-3min(从表面消毒的颖果中取出后)。
(二)剥胚
小胚可在双目解剖显微镜下切取，微胚和幼胚用微解剖针和微解剖刀。用具镊子、解剖针、解剖刀、刀片和巴斯德吸移管先用高压蒸气或在干燥烘箱中消毒，或用70-75%乙醇。每次用过后，仍将它浸入70-75%乙醇，用时在火焰上烧去酒精或用无菌纸擦干。有时不用火焰以避免可能产生火伤(由于残留乙醇存在)，以及热引起气浪可以增高污染率。
切取埋在液体胚乳中的未成熟胚，常在珠孔端切割，在另一端加压，使胚从切口挤出，应注意不压伤脆弱胚原组织。例如大豆当胚处在球形后期和心形期时(长0．1-0．3mm)，胚乳基本上是液体，胚周围已形成一层细胞状胚乳，常用挤压这种胚原组织取胚。
当切取心形期和较幼胚时，要注意保持胚柄完整。这是胚发育早期吸收营养场所。Yeung(1980)报道当在心形期把标记蔗糖溶液引入菜豆胚乳囊，胚柄内和胚的胚柄端出现放射性。另一方面，子叶是成熟胚的主要营养吸收处所。Ceccarelli等(1981)证明很幼菜豆种子内，胚柄是生长物质如赤酸素生物合成的主要活跃场所。Cionini等(1976)首次肯定胚柄对离体培养幼胚生长的重要性。观察到红花菜豆胚(长小于5mm)培养中，除去胚柄，降低胚发育。Yeung等(1979)证实了培养菜豆心形早期胚时，胚柄完整的比热杀死的完整胚柄，鲜重增高二倍和植株再生。Hu等(未发表)培养0．1-1．0mm大豆胚(球形后期到子叶形早期)发现，有胚柄的比无胚柄的，胚增多二倍，增长四倍或以上。Monnier(1978)怀疑许多幼胚培养失败的可能理由之一，是损失了胚柄的重要功能，如内生荷尔蒙生物合成和营养运转，胚柄破损所产生的损伤等。菜豆较老胚(长达5mm)或心形后期和子叶形早期在人工培养下发育不受除去胚柄的影响。
解剖时应注意脱水对未成熟胚的损害，则解剖时在幼胚株上加一滴无菌培养液或蒸馏水，或在装有液体的培养皿或表玻面内进行。然后用巴斯德或毛细管吸移器吸取转入培养瓶。
(三)培养基
成熟期或近成熟期的胚是完全自养的。它们能在加能源——蔗糖的简单无机培养基上发芽。当用较幼胚时，培养要求随之逐步复杂化，以利胚表达其总发育潜势。Raghavan(1965)指出胚发育从极度异养到自养，有赖于关键酶系统逐步活化，或生化途径，尤其是涉及蛋白质合成和／或生长物质。他采用不同发育时期的荠属胚人工培养：成熟胚对培养基要求是大元素盐类加2%蔗糖；鱼雷形胚要大元素+2%蔗糖十维生素；中期胚要大元素+2%蔗糖+维生素+微量元素；球形后期要大元素+2%蔗糖+维生素+微量元素+荷尔蒙；球形早期胚所需培养基尚属不知。
培养基改进的主要目标是，抑制离体未成熟胚的“过早发芽”。Hannig(1904)是研究这个难题的首创者。发现未充分发育的胚，如果在人工培养不能生长，则过早发芽，长成小苗，而不是完成正常胚原发育。过早发芽的幼苗弱，只出现切取胚时已有的结构。目前胚培养仍是如此。Norstog(1979)汇综了抑制各个种过早发芽的培养基因素：高渗透压，高水平钾，以有机酸的铵盐增高培养基氮含量，ABA，和可能的低氧强。
离体未成熟胚在培养发育期间，逐步改变营养需要是合乎期望的。常指把胚从一种培养基转入另一种，以求最适生长。细菌转移环(各种大小)是其理想工具。Monnier(1978)设计一种方案，保证培养基成分随时间而连续变化。在培养皿内，并列装二种不同成分培养基。第一种培养基倒入放在中央的小玻璃容器中，固化后，取去中央玻璃容器。在空孔中，倒入不同成分的第二种培养基，把离体胚接种其上。作为扩散的结果，胚将随着培养时间受到不同培养基的作用。他采用这种设计，首次把荠属胚从球形早期(50μm)生长到成熟，而毫不间断。
1．无机盐类 White(1963)，Murashige与Skoog(1962)和Gamborg＇sB5培养基加以改进是胚培养用得最广的基础培养基。Norstog(1967)发现高浓度钾能抑制大麦胚(0．2-0．4mm)的过早发芽，和改进生存率，而不要高渗透压。Monnier(1978)增高MS的钾(加350mg／L KCl)和钙(CaCl2加倍)水平，降低还原铵(NH4NO3)和Fe EDTA近半，加倍微量元素，能显着改进荠属Capsella未成熟胚生存率。以后(1980)发现KCl比KNO3对增高荠属未成胚生存率为好。
2．碳水化合物 蔗糖是胚培养最常用的碳源。而葡萄糖支持菖蒲、蔷薇科几个种、百合属杂种胚生长和成熟百合胚生长比蔗糖或许较好。
碳水化合物对保持培养基适宜渗透性有重要作用。高渗透值是未成熟胚珠自然液汁的特征。心形期棉胚周围胚乳液渗透压为10大气压。菜豆是0．7(心形期)和0．5(子叶后期)。鱼雷期荠属胚珠汁8．4。因此，未成熟胚培养用高水平蔗糖(高渗透压)，并发现有利于促进胚原发育和抑制过早发芽。
一般言之，胚愈幼，所需渗透压愈高。Rietsema等(1953)发现不同发育时期的蔓陀罗胚需要最低蔗糖浓度不同，达到人工培养生长：心期前(0．1mm)8-12%；心后期(0．2mm)4%；鱼雷早期(1mm)1%；鱼雷期(2mm)0．1%；近于成熟胚甚至在不加蔗糖时生长。为了证明生长促进效应与渗透压的关系，他们把蔗糖固定在2%，用调节甘露糖醇浓度增高培养基渗透值。0%甘露糖醇时(2．0大气压)鱼雷期胚生长好，增高渗透值会有相当抑制现象。心期胚1%(3．2大气压)生长最好，心期前只有增加到2%(4．5大气压)才能生长。他们也试验了增高蔗糖用量，用降低甘露糖醇以保持渗透值，无论胚年龄如何，用约2%蔗糖达到最大生长。很明显未成熟胚要求2%以上蔗糖，是与渗透性有关而非代谢所需。应注意甘露糖醇对胚培养有毒。Pretova(1974)测定不同蔗糖浓度培养基的渗透值：2%1．7bar；5%4．0bar，10%8．2bar，15%12．7bar。用非碳水化合物也能调节渗透值如NaCl。
兹举例以示不同种未成熟胚培养用的蔗糖浓度：Norstog(1961)用12%以保持长60μm大麦胚的连续胚原生长，而降低用量趋于诱导过早发芽。亚麻球形和心形期胚完成胚胎发生也要相同蔗糖浓度。Cameron-Mills等(1977)用9%控制0．2-0．8mm大麦胚的过早发芽和促进胚原发育。培养后9和13天分别转移6%和3%蔗糖培养基。8%蔗糖支持0．2-0．4mm大豆心形胚最好胚原生长。虽然4%时，支持近乎相同生长，稍见根生长和过早发芽。较高(12%)或较低(2%，1%)蔗糖浓度导致大多数胚生长差或不能生长。0．3-1．0mm离体玉米胚的正常发育和发芽需要5%蔗糖的培养基。4%蔗糖能支持11个冬青种未完全发育心形胚正常胚原发育(Hu1975)。同样浓度(4%)对5-6天龄未成熟水稻胚发育成苗较好，与较低(3%)或较高(5%，6%)时相比的话。Custers(1981)用3．5%蔗糖使心形(0．1-0．8mm)黄瓜属胚生长。
3．氮NH4NO3和KNO3是胚培养常用无机氨源。文献指出无机氮利用视种和胚而异。铵态氮是荠属，兰科和蔓陀罗所需，而黄麻属以NO3为好。Norstog(1967)使用苹果铵加谷酰胺和高钾盐的低蔗糖培养基，培养0．2-0．4mm大麦胚，生长增高无过早发芽。Mauney等(1967)用4g／l苹果酸铵渗透压8大气压比不加时最适渗透压低2大气压，0．2-0．3mm心形期棉胚生长极好。可见当用铵盐时，以与有机酸尤其苹果酸或柠檬酸离子为宜。
各种氨基酸及其酸胺中，谷酰胺对人工培养胚生长最有效。门冬酰胺对有些种也有效如蔓陀罗，但对其它种有所抑制如荠属、拟南芥属、木犀草属。其余或有促进或有抑制。Brown1906年早已认识到谷酰胺对未成熟大麦胚生长的刺激效应，以后报道在含水解酪蛋白培养基加2．7mM谷酰胺，使大麦胚生活力起点从0．35mm降到0．25mm，生长潜势增高。Mok等(1978)也发现谷酰胺有效地增高菜豆属未成熟种间杂种胚的生存率。蔓陀罗和白果未成熟胚培养结果也如此。Rijven(1955，1956)比较研究9科中的11属(荠属，海绿属，矮牵牛属，藜属，Arabidopsis，大蒜芥属，木犀草属，醉蝶花属，苜蓿属，葱属和大麦属)鱼雷形胚对谷酰胺和门冬酰胺的利用。指出毫无例外，谷酰胺优于门冬酰胺。发现谷酰胺促进荠属胚生长比谷氨酸更有效。Hu等(未发表)用0．2-0．5未成熟大豆胚结果证实了这种效果。
水解酪蛋白(CH)常用于胚培养以促进生长，增加胚原分化和胚大小。Sandens等(1948)用以培养胡萝卜属二个种心形期前(0．1-0．25mm)胚，发现20种氨基酸混合物与CH同样有效，但单用时无一能以超过CH或其混合物。由此提出氨基酸间的协同作用。Ziebur等(1950)培养大麦未成熟胚(长1．4-2．8mm，授粉后约10-15天)，发现在对照培养基中加CH1%抑制过早发芽和刺激胚原生长，胚常超过正常胚大小。结论发芽的抑制是CH高渗透压结果。CH的氨基酸和磷酸盐作为胚生长的营养物。Cameron-Mills等(1977)报道CH0．05mg／1仍能降低1．2mm大麦胚(对照)生活力形态起点到0．55mm。Rangaswamy(1961)报道CH是四季桔很幼球形胚(长14-28mm)培养所需，在基础培养基上，这些前胚培养3天内完全破碎。增高蔗糖到10%仍不能支持正常胚原发育。但加400mg／lCH时，80%胚原发育正常，3-4周内形成成熟胚。小黑麦黄瓜属和水稻；Koa等(1983)用加CH培养基培养其幼胚也能阻止过早发芽和促进胚原发育。
CH和氨基酸和酰胺是高压消毒的。许多研究用lg／lCH和100mg／1个别氨基酸和酰胺为起点浓度。
4．天然植物提取物和组织 Van Overbeek等(1941)用加非高压消毒CW培养基培养蔓陀罗球形胚，长约0．2-0．5mm，在无CW基上，生长失败或微弱，经转而产生愈伤组织。但在含CW培养基上，一周内增长几倍，无过早发芽迹象。提出在胚乳汁中含有某种“胚因子”。以后，CW成为培养未成熟胚和其它组织、器官的最有效附加物。可能由于CW补足着某些糖类、氨基酸、生长荷尔蒙和其它关键代谢产物在培养基中的缺失。
曾发现CW促进生长：66μm长离体甘蔗胚；未分化大麦胚长60μm，含有细胞不超过100个；大麦胚长0．35mm；20日龄番茄胚；幼子叶期胡萝卜胚0．45一0．6mm长；豇豆属未成熟异种杂种胚，甚至蕨胚。CW对促进人工培养胚原发育不常有效。10日龄(0．3mm以上)玉米胚，龙葵胚，番茄杂种胚，和小于1mm大豆幼胚，加CW并非有益效果。所谓CW的胚因子似抗热的。由此CW可用过滤和高压蒸气消毒。作者常用15%(v／v)CW，可为CW是否有效作出合理判别。
发现CW效应后，曾用许多种植物的各部分或胚乳提取物或离体组织测验存在“胚因子”可能性。结果是混乱的。一般言之，如果提取物或组织有促进胚生长活性，常能促进若干无关系种生长，但不一定对它的本种有效。由此可知这种“胚因子”既非种专化的又无普遍性。必需分别测验决定。天然提取物如CW的缺点是其效力不稳定，为此以用化学规定的培养基为好。
天然植物提取物对人工培养胚生长发生正效应的举例如下：Lampe等(1933)用玉米种子高压蒸气消毒的提取物对未成熟玉米胚生长有效。用白果大配子体提取物能促进其幼胚生长。胡萝卜属胚珠提取物刺激其胚生长。枣和香蕉水提物促进大麦未成熟胚生长，抑制过早发芽，小麦麸质和番茄汁效果与CW相同，以后者为最好。Matsubara(1962)用鸢尾属，胡萝卜属，羽扇豆属，佛手瓜属，玉米属，茶属，山茶属，李属，茑萝属幼种子，和佛手瓜属老种子和银杏属大孢子体，和培养的很小胡萝卜属胚的乙醇提取物，发现胡萝卜属和佛手瓜属的活性与CW相同，而羽扇豆属种子的效果大二倍。Gortet(1955)报道未分化、棍棒形仙客来属胚培养CW，YE，或泥炭提取物培养基上，约14天内长到成熟。可奇的是泥炭提取物上生长最好。
培养基直接加胚乳组织培养未成熟胚也能诱导正效果。用离体大麦胚乳加入培养基放在大麦胚周围，能从0．5mm胚长成幼苗。黑麦草胚乳组织培养体和胚有相同效果。大麦胚乳也能促进萝卜属和荠属胚生长。同样，从大麦×小麦幼颖取胚培养在含玉米乳熟胚乳培养基上取得成功。母体胚乳对大麦×小麦杂种胚长0．2mm或以下生长有稳定生长促进效应。Bajaj(1980)将小麦×黑麦杂种胚(不亲和杂交)放在一层小麦浸软未成熟胚乳上，生长相当增强。Asano(1980)用克隆间杂交的胚乳为培养基中看护组织，培养百合属60%未成熟异种杂种胚(0．3-0．4mm)的正常胚原发育。Williams(1980)用看护胚乳培养车轴草属胚，取得二株成熟异种杂种。Williams等(1980)把牧草豆科属车轴草属，百脉根属和Onithopus未成熟异种杂种胚接种在从正常发育中胚珠取出的看护胚乳上，它们在看护胚乳内，转入无菌营养琼脂培养基后，培养到幼苗期。Webb(1982)报道被子植物大配子体(胚乳相对物)刺激了苏铁属胚的初生和二生根伸长和二生根产生。雌配子体或其压碎的提取物存在时，人工培养Douglas枞胚的总长、大小，根长和子叶色均有明显改进。
5．生长调节剂 一般言之，胚培养不需生长调节剂，除很幼胚和克隆繁殖外。前者常用生长调节剂克服过早发芽或刺激胚原生长。最有效的是ABA，正常存在于发育中胚珠内，设想是抑制过早发芽和保持发育中胚按正常胚原发育进行。ABA抑制大麦和菜豆属过早发芽，对胚生长无抑制作用。ABA存在时，不再要保持培养基高渗透压。GA和细胞分裂素对过早发芽有相反效应，如培养的菜豆胚和大麦胚。ABA对GA诱导作用有反作用。Custers(1982)报道了高蔗糖浓度增强培养的黄瓜属幼胚连续正常胚原发育(与过早发芽相反)，而高浓度KIN对此有反作用。
很幼胚生长能为细胞分裂素、生长素或GA所促进。一般人工培养植物胚不要外源生长素。LaRue(1936)发现低浓度IAA促进几个种的胚发育包括玉米。Custers(1982)用0．01mg／lIAA培养未成熟Cucumis幼胚。作者用0．1μM NAA培养未成熟大豆胚。单用细胞分裂素对荠属很幼胚生长无效或稍有促进。Raghavan等(1963)发现低浓度IAA，KIN，和硫酸腺嘌呤相配合，能支持荠属球形胚生长和分化。Custers(1982)指出离体黄瓜属未成熟胚的完成胚形态建成最后阶段需要低到中等细胞分裂素含量。很低水平(约0．0lmg／l)GA可能促进大麦幼胚胚胎发生，而无过早发芽。GA对促进菜豆属离体心形期胚生长有效，尤其当切除胚柄(生物合成内生GA活跃场所)为甚。低浓度ABA能促进培养的大麦胚分化，对菜豆胚生长稍有加强。
6．载体材料 琼脂是最常用胶质以固化培养基，与液体培养基比较，培养的大麦、矮牵牛属和亚麻胚生长较好。常用浓度0．5-1．5%。高浓度琼脂，由于其亲水性，使可给态水降低，限制着胚生长。Stoltz(1971)证实了人工培养发芽的Iris胚生长量与琼脂浓度成反比例。提出为了取得最大生长，应将琼脂浓度尽可能保持在只足以支持胚重所需的胶质状态。Hu(1975)提出大多数胚培养用0．7%琼脂。不用琼脂对玉米未成熟胚生长无影响。Pence等(1980)发现可可未成熟胚静置液培比半固化培养基的生长为好，分别长25．1对18．6mm。液培中子叶更卷曲和较厚，类似活体内发育的子叶。培养中低氧强或是抑制过早发芽和促进正常胚原发育重要因子。当大豆未成熟胚沉没在液体培养基中，比浮在表面的，其子叶显着较重，下胚轴较短。
pH值低时，由于酸解，胶凝差，长时期加热或高压蒸气消毒也将破坏琼脂和阻碍凝胶。pH高时可能发生过硬。
琼脂不是生理惰性，是各种数量的刺激或抑制物质之源。也可能限制胚产生的代谢废物扩散。活性碳可能吸附琼脂含有的有害物质或由生长中胚释放的物质。
聚丙烯酰胺，硅胶和玻璃纤维曾用做代用品，可避免琼脂的杂质，已证明是必要的。有时用滤纸桥或平台，浸在液体培养基中，作为胚生长的载体表面。这样通气较好。
7．培养基pH pH对胚培养的影响研究很少。Tukey(1938)培养李属成熟胚时，测验了pH3．8，5．2，6．0，7．2，8．2和8．6。除pH8．6时幼苗叶稍有失绿和pH3．8因过酸而液化外，其余概无不利影响。Asano等(1977)发现pH4．4和5．0，培养的百合未成熟杂种胚生存率最高和正常幼苗最多，而pH4．4以下苗纤弱。多数学者常用pH5．0和6．0，适于大多数种胚生长中的胚，虽然经常通过预备试验而明确具体材料的最适pH值。Liang等(1978)研究棉杂种胚发现，在pH5-6White培养基培养10天后，幼苗根变成棕色，有再生植株甚至枯萎。pH5，6，7培养基上的弱和枯萎再生株百分分别为50．0，33．3和16．7。因此选择了pH7，用于继后试验。
常在高压蒸气消毒测定培养基pH。但这种消毒过程中常会降低pH值。通常为了部分补偿这种不可控制的变化，通常比所需pH值调高pH0．5单位。高压蒸气消毒使pH变化程度，与培养基成分和附加物有关。作者研究蔗糖浓度对大豆未成熟胚生长影响，虽将启动pH各项试验一律调到6．0，培养后，加蔗糖处理1，2，4，8和16%，pH分别下降到5．48，5．37，5．35，5．19和4．90。这就影响到试验资料是否真实的处理间差异。
(四)培养条件
1．光 培养成熟胚诱导正常发芽需要一定光谱培养幼胚时，常测验光培和暗培的效应，找出更适合于已知培养系统的条件。由于光可能刺激过早发芽，提出先用暗培未成熟胚，以诱导胚胎发生，然后转入光培，诱导发芽。最近采用于培养未成熟胚。例如大麦葱属异种杂种，山羊麦属×大麦属杂种，水稻和亚麻。
大多数胚虽能在光或暗条件下生长，有些胚则不然。发育不全的心形期胚(许多冬青种)在离体培养下是光敏感的。在培养Ilex opaca残胚最初4天内，当每天暴光4000lx4h或以上，能诱导产生难驯化的次生休眠，继后暗培或用广大浓度范围GA处理也不能使之恢复。但经最初4天暗培，这类胚光敏感性消失，即使在光培下，生长成熟。
光培可在常光或某种光、暗程序下进行。大多数学者用16h光，8 h暗，有人选用12∶12，少数学者选用20∶4，18∶6和10∶14。这些常是人为任意选定的，而不是试验测定的。
2．温 Dunwell(1981)用五种培养温度：5，10，15，20和25℃。指出大麦基因型R231(颖果)种子，只有在15℃发芽，而离体胚15，20和25℃都能发芽。如果延长发芽时间，颖果与离体胚将在较低温度5和10℃开始发芽。多数学者选用25±2℃，不论植物类型如何。似已能满足支持胚原生长和发芽的一般要求，当然不一定是最适的。同种不同基因型最适温度不同，同一基因型的每种生长参数如芽长、根长、鲜重和干重也是如此。Dunwell(1981；1983)进行大麦胚培养系统试验证实了这种复杂性。适应于温暖地区或季节的种胚培养温度。例如Zamia27℃，菜豆属28℃，棉属30℃。寒带或季节的适应种胚培养要求：大麦异种杂种22℃，水稻17-18℃，芸苔属杂种杂种15℃。
(五)移植
移植成功因素，应考虑侵染和干萎。土壤消毒可消除侵染机会。移植后保湿，使之适应于外界环境，很有必要。在驯化期间，在2-3周内逐步降低湿度，这个期间幼苗进形态和生理适应，使之发育成陆生状态。
根系不发达的再生株，移植时可加0．5μM NAA，使每株根数从1．8(对照)增加到6．3，不产生愈伤组织，后者会导致移植苗腐烂。这是Stoltz(1977)用冬青属成熟胚培养的结果。
【参考文献】：
〔1〕Bhojwani，S．S．and M．K．Razdan 1983 Zygotic embryo culture．In： Plant Tissue Culture，Theory and Practice．pp．199-235，Elesevier，Amsterdam，Monnier，M．1978 Culture of zygotic embryos．In：Frontiers of plant Tissure Culture．(T．A．Thorpe ed．)pp．277-286，Univ．of Calgary Press，Calgary．
〔2〕Nostog，K．1979 Embryo Culture as a tool in the study of comparative and development morphology．In：Plant Cell and Tissue Culture．(W．R．Sharp，P．O．Larsen，E．F．Paddock and V．Roghavan eds．)pp．179-202，Ohio State Univ．Press，Columbus．
〔3〕Raghavan，V．1976 Experimental Embryogenesis in Vascular Plants．Academic Press，New York．
〔4〕Raghavan V．，1977 Applied aspects of embryo culture．In：Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell，Tissue and Organ Culture(J．Reincrt and Y．P．S．Bajaj eds．)pp．375-397，Springer Verlag，Berlin．
〔5〕Raghavan，V．1980 Embryo culture In： Perspectives in Plant Cell and Tissu e Culture．International Review of Cytology Suppl．11B(I．K．Vasil ed．)pp．209-240 Academic Press，New York．
〔6〕Wardlaw，C．W．1965 Physiology of embryonic development in conmophytes．Encyclopedia of Plant Physiology，vol．15／1(W．Ruhland ed．)pp．844-965，Springer Verlag，Berlin．