不同植物的保存法
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第290页（11109字）
植物不同属所用的保存方法列于表13-10。这表说明，使用了慢速冷冻法或逐步冷冻法，就不能用快速冷冻法，反之亦然。只有草莓属例外，两种方法都能成功地运用。但分析同科不同属，可得到一些规律。在茄种中两种方法都有，但没什么理由可解释，为什么一种能用于蔓陀罗或烟草属的方法不能用于番茄属或茄属。另外，综观所有文献，可得出能否成功地使用某一种方法，或多或少取决如何进行研究。因此，没有“+”号并不表明该方面不能使用，可能是在这种情况下的研究工作尚未进行。
表13-10 用于组织保存研究的一些属和方法
1．五加目 胡萝卜。这是组织培养的经典材料，因此它也作为基本材料用于种质保存的研究中。胡萝卜组织培养最常用的培养基是加有2，4-D的MS培养基。
逐步冷冻法的试验曾对基因型、低温防护剂、冷却速度、贮藏温度和持续时间以及解冻方法的影响作过讨论。
所有文献只提及野生型胡萝卜基因型的影响。低温防护剂包括DMSO、甘油和蔗糖都已试验过，以5-7%(最多达10%)的DMSO效果最好；最适的冷却速度是-1——2℃／min，降至-40℃或更低，然后保存在液氮中。细胞可贮藏在-78℃下，但随贮藏时间的延长，细胞存活率也将逐步下降。快速解冻是所用过的解冻法中最好的。Withers和Street(1977)使用同步细胞测验，发现用滞后期或指数生长早期的细胞其生活力最强。
干燥冰冻法是由Wither3提出，用低温保护剂处理后，将由胚发育而成的幼苗切下(1-3cm)，把表面水分吸干，然后将幼苗用慢速冷冻法进行冷冻。这些经干燥冷冻并解冻的幼苗，在茎和根的分生组织区会表现出不规则的生长，而当培养基中加活性炭后，就会进行有规则的生长。
愈伤组织干燥法是由Nitgsche在研究胡萝卜时发展起来的。当愈伤组织生长在Gamborg&Eveleigh培养基上时，经干燥后不能存活，而在同样培养基上，用0．15M的蔗糖浓度代替0．58M，并外加37．8μMABA，生长16天后虽干燥但不丧失生活力。由于干燥愈伤组织内的残留水含量较低，因此可以不用低温防护剂而冷冻在-80℃下，或者在低温条件下保存在室温下。在25%相对湿度和15℃下，愈伤组织可贮藏二年以上，而不丧失生活力。四周后能在原来的培养基上重新生长，并发育成植株。
2．石竹目 康乃馨，带有两个叶原基的茎尖，能生长在MS培养茎的无机元素与加1．1μM盐酸硫胺素、0．55mM肌醇、0．57μM IAA、2．3μM KIN和0．87M蔗糖的培养茎上。Seibert(1976)和Seibert和Wetherbee(1977)曾对康乃馨作过快速冷冻法试验。以栽培种Scania和Ellen Marie为材料，在液氮中冷冻两个多月，并快速解冻，其细胞存活率分别为33%和51%。用Scania和Linda品种进一步试验表明，冷却速度在-50℃／min时较合适。在冷冻前若将茎尖先在4℃下驯化四天，则存活率可增至60%。这些结果在一年中任何季节都可用实验证实，只有在1、2月份短日照条件下，栽培种Pink Sim的茎尖才有生活力，Scania需要6-7周的短日照处理，而Ellen Marie需9周处理。目前还不能确定这些不同，是否就是基因型的差别所致。
3．豆目
(1)大豆 Bajaj(1976)试验大豆细胞悬液培养体的保存。细胞培养体在White培养基上，另加11．0μM NAA和0．47μM KIN。预处理最好用5%DMSO，冷冻过程采取-2℃／min速度降至-196℃，用TTC降解法测得材料的存活率为20%。
(2)牛角花 Tomas(1979)提出用缓慢生长法保存牛角花，将栽培种Lea的茎节培养在含有0．22μM BA(BA-4和BA-H)的B5培养基上，和既无激动素也无生长素的B5-H培养基上。试验结果表明，BA-4中生长的11种基因型和在B5-H上生长的19种基因型，在2-4℃下保存4周后都能存活，存活率可达91-100%。
(3)三叶草 苜蓿。Cheyne和Pale(1980)和Bhojwani(1981)曾对这些饲料豆科植物用缓慢生长法进行试验，使用的种和变种有：葡萄三叶草的变种S100、S184和Huia；草地三叶草的变种S123、Norseman(四倍体)；苜蓿的变种Sabilt。
将苗、茎尖及分生组织培养在含有1．1μM IAA和0．98μM 2iP(三叶草)或1．1μM NAA(苜蓿)的B5培养基上，或者培养在MS无机盐加4．0μM烟酸、0．4μM盐酸吡哆醇、0．3μM盐酸硫胺素、0．55mM肌醇、0．09mM腺嘌呤硫酸盐、0．06M蔗糖和8g／1淀粉的BM培养基上。有时，Blaydes(1966)培养基与Miller(1963)培养基同样也能成功地利用。
温度2-6℃，光强3001x／8h或完全黑暗条件下，贮藏15-18个月后，通过4-8周的诱导再生，再测其生活力，存活率分别为：匍匐三叶草变种S100，为92%；Hala变种为100%(贮藏10个月后)；草地三叶草变种S123为83%；Norseman变种为83%；苜蓿变种Sabilt为81%。
用光和黑暗处理并没有发现有真正差异，每组培养物中的幼苗数取决于贮藏时间，从1个月到10个月，苗数从15株减少至10株。
(4)豌豆 Kartha等(1979)进行冷冻保藏试验的起始材料就是豌豆叶原基的分生组织，它们生长在B5培养茎上，外加0．5μM BA、低温防护剂DMSO、甘油和聚乙二醇，供试浓度从0-20%。处理步骤是，在0℃下用低温保护剂处理30min，间隔10min后，按-0．5——1℃／min速度冷冻，直至温度下降到-40℃，然后贮藏在液氮中至少从一小时到26周，快速解冻后，分生组织清洗四次，接着诱导培养3周。其生活力以愈伤组织结构和苗数量来反映，用0-5%DMSO、0%乙醇或0-15%甘油处理，可得到100%苗产量。冷冻速度为-0．6℃／min较为合适，贮藏1周和26周，其生活力并无差别。
4．拢牛儿苗目 亚麻。
牛儿苗目中唯一被试验过的植物就是亚麻。细胞培养的条件是：MS基本培养茎，另加0．12M蔗糖，1．0mM L-谷氨酰胺，0．7mM盐酸半胱氨酸，3．0μM盐酸硫胺素，4．5μM2，4-D，低温防护剂为10%DMSO，所用的冷冻速度为-5——10℃／min，在-50℃下贮藏1个月后，细胞悬液体很快被解冻，并清洗3次，用TTC法测得的存活率为14%。
5．报春花目 四季樱草。Bajaj(1981)将四季樱草花药培养于MS培养基中，并加入2．9μM IAA、2．3μM 2，4-D和9．1μM ZEA，在26℃下培养三周，未观察到有愈伤组织或胚状体的生长。用2%DMSO和0．2M蔗糖处理花药2小时，然后移去低温防护剂溶液，用无菌滤纸吸干花药后，很快将它冷冻到-19℃，经快速解冻后，进一步培养，能再生出单倍体植株。
6．蔷薇目
(1)松草莓 已建立了松草莓育种和增殖的组织培养方法。从实际需要出发，试管中组织的贮存已成为一个感兴趣的问题。Mullia和Schlegel(1976)进行缓慢生长法试验。无菌苗生长的培养基组成是：11knop溶液的大量元素，加0．5m 1Berthelot溶液(微量元素)，3．0μM盐酸硫胺素，4．1μM烟酸，2．4μM盐酸吡哆醇，0．03mM甘氨酸，0．55mM肌醇，14．2μM IAA，0．47μM KIN。每支试管中装有2．5ml培养液，植株生长在滤纸上，贮藏在1℃和4℃的冰箱中。所有58种不同基因型植株都被试验过。每隔3个月检查一次，在有干化迹象的试管中滴1-2滴溶液，这些材料能贮藏6年。贮藏在1℃下所得的试验结果，要比在4℃下的好。这种方法经济实惠。
Kartha等(1980)以草莓为材料，进行冷冻法处理。他们将分生组织从植株上分离下来，在试管中加以繁殖，先培养在含10μM BA的MS中，外加5%DMSO，处理2天，或以不同浓度的甘油处理1-3天，在0℃下，加入每种低温防护剂60-120min，然后逐步冷冻至-40℃，再将培养体放入液氮中，或者直接投入液氮中加以快速冷冻。
合适的冷冻速度为-0．84℃／min，这样存活率可达95%。测试范围是-0．56-0．95℃／min。快速冷冻和快速干燥冷冻法所得的存活率仅为5-7%。用甘油预处理所得的存活率要比用5%DMSO的为低。在液氮中贮藏一周后，植株存活并再生率为95%，但2-8周后，存活率减到50-60%。
(2)栽培海棠 Lunclergan和Janick(1979)用低温贮藏法对试管栽培海棠进行了试验。栽培海棠茎尖培养在MS培养茎上，另加0．3μM盐酸硫胺素，2．4μM吡哆醇，4．0μM烟酸，0．3mM甘氨酸，22μM BA，0．087M蔗糖和10g／l淀粉。贮藏12个月后测得，在-17℃下存活率为0%，1℃下为100%，4℃下为70%，26℃下为30%。在低温条件下，每一培养瓶中平均苗数随贮藏时间而增加。
(3)欧洲酸樱桃 Turmanov等(1968)测试李属愈伤组织冷冻后的生活力，在White或MS培养基上，将愈伤组织在26℃下培养10天，并用从2%到15%的不同蔗糖含量，然后愈伤组织分别保存在-4、-7、-10、-13、-15、-20、-25、-30、-35、-40和-50℃下，结果表明，对低浓度蔗糖、愈伤组织能在-25℃下存活；对高浓度蔗糖，愈伤组织能在-30℃至-40℃下存活。直至蔗糖浓度高达愈伤组织千重的50%时，仍是如此。
7．鼠李目 沙葡萄Glazy(1969)用沙葡萄苗缓慢生长的实验。无菌的萌枝生长在培养基中，其组成为0．51 knop溶液，另加0．5m lBorthelot微量元素，和硫胺素、吡哆醇、烟酸、泛酸钙、肌醇、生物素等，加蔗糖0．04M，在2℃下贮藏24天后的存活率为13%，在7℃下为46%，9℃下100%。在9℃下贮藏42天后仍为100%。在最高温度下萌枝能贮藏300天而不丧失生活力，但枝条不伸长。
8．无患子目 假挪威槭。假挪威槭是常用于组织保存研究的物种之一。培养基为WH，含有27．0μm2，4-D、10%椰乳，也能培养在LS培养基或Stuart和Street(1969)培养基上。Sugaware和Sakai(1974)确定了合适的贮藏条件，即用24%DMSO(W／V)和0．55M葡萄糖(W／V)的水溶液，慢速冷冻至-40——50℃，然后贮藏于液氮中。试验表明取分裂间期、后期或前期的细胞似乎很有必要。Nag和Street(1975)报道使用5%DMSO，-2℃／min的冷冻速度至-65℃，并冷贮藏在液氮中，然后快速解冻，可获得2%的存活率。
从Wither和Davay(1978)以及Withers(1978)对假挪威槭的研究结果看，慢速冷冻法较合适。他们采用的冷冻速度为-1℃／min，迅速解冻后，进行电镜观察。在低温防护剂下进行慢速冷冻，伴随着细胞大小改变，这是脱水的结果，导致细胞内冰块结构减少，也能较好地保持细胞器的完整性。试验结果表明，只有用低温防护剂处理的细胞才能存活，即使在这些细胞中，仍有一些超微结构发生改变。
9．桔梗目 菊。桔梗目中唯一被研究过的植物就是菊。它的驯化实验和缓慢生长实验是由Banner和Stepon Sus(1976)做的。其驯化是在MS培养基上，含有4．6μM KIN，5．4μM NAA，0．55mM肌醇，200mg／1水解酪蛋白，100m1／1 CW，在27℃下培养10，17，31，45，59天后，将愈伤组织在4．5℃下驯化0，1，2，4，6星期，然后逐步冷冻至-4，-5，-6，-9，-12和-15℃。最好的结合方式是10天预培养和4-6周驯化，栽培品种Shining，Light，Jassamine，John Milorathe等在-15℃下驯化四周能够存活，Chiquita和Larry栽培品种则在-16．1℃下驯化六周也能存活。
单冠菊。同其他菊科植物相比，单冠菊对冷冻非常敏感，不加低温防护剂而对纤细单冠菊进行细胞悬浮培养。Towill和Mazur(1976)观察到，培养在Erikkson培养基上，并以-0．1℃／min的冷却速度从-1℃冷冻到-10℃，可得到10%的细胞存活，细胞冷冻在蒸馏水中时，存活率较低。Hollen和Blaktly(1975)用拉温尼单冠菊进行实验，用-1．3——3℃／min的冷却速度和10%的DMSO，他们发现其生活能力要比从-20℃下迅速解冻的高3-5倍，但不能长期贮藏在-20℃下。细胞取样的最佳时期似乎是对数期的早期，因为这些快速生长着的细胞对冷冻有最大抗性。
10．茄目
(1)颠茄 茄科的冷冻实验很引人注目。因为这个目包括许多有重要经济价值的植物，其中大多数是生长在热带或亚热带，因此用低温冷冻驯化，其条件很难预料。
Nag和Street(1975)用颠茄做过实验，将其愈伤组织培养在Thomas和Street(1972)的SSM培养基上，另加11．0μM NAA，用不同的低温防护剂(DMSO，甘油)进行试验，同时冷冻速度变动在0．5-65℃／min之间。发现在5%DMSO和1-2℃／min的冷却速度下效果最好。如缺少低温防护剂，细胞在-10——30℃之间死亡。加入DMSO，细胞的存活率从2℃的90%下降到-60℃的28%，温度再次下降，这数字也保持恒定。通过快速解冻，然后培养在上述含NAA的培养基上，这些存活细胞能发育成胚状体。
(2)一年生椒 Withers和Street(1977)曾报道过一年生椒的低温保存法。通过增加甘露醇浓度研究克分子浓度的影响。培养体生长在LS培养基上，外加1．8μM 2，4-D和0．14μM KIN，加入甘露醇的浓度从0．0M，0．05M和0．29M(w／v)不等，通过7天的培养，细胞直径从120μm下降到85μm再到72μm，冷却过程是：用甘油(10%)和DMSO(5%)作为低温防护剂，冷却速度为1-2℃／min至-100℃，然后贮藏在-196℃中。
解冻用40℃水浴进行，然后细胞悬浮体用新鲜培养基按1∶50进行稀释。如果培养在2℃下，辣椒细胞表现对冷害的高度敏感性，但如果有5%甘露醇，并用低温防护剂转接处理，70%的细胞能够存活生长，如再另加冷冻步骤，则存活率降为25-20%。
Withers(1976)曾用一年生辣椒进行缓慢生长试验，愈伤组织在4℃下培养25天仍然存活。
(3)曼陀罗 同其他茄种植物一种，曼陀罗对组织培养有卓越反应。曼陀罗组织保存只有Bajaj(1976)研究过。将它培养在含2．3μM2，4-D的MS培养基上，经7%DMSO预处理后，按1-3℃／min的冷冻速度将细胞冷冻到-196℃，存活率是通过三苯基四唑化氯的降解，在546nm测吸收值取得。冷却速度为1℃／min时，存活率最高。
(4)甘薯 Latta(1971)研究旋花科甘薯的抗冷冻性，他用三年龄细胞培养在67V培养基上，并与胡萝卜比较，加入低温防护剂后，发现甘薯细胞的渗透性比胡萝卜的小得多，这主要是由于蔗糖含量所引起。因此，能成功地用于胡萝卜的方法却不能用于甘薯细胞。但如果培养在含65%蔗糖的培养基上，并加2．5%甘油和2．5%DMSO时，贮藏在-40℃下，细胞的生活力仍很强。
(5)番茄 Grout等用茄科植物番茄试验，将基部长为18-20mm的幼苗经表面消毒，在0℃下放入含有0．08M蔗糖的MS培养基中。在2h内，每间隔20min内逐步加入低温防护剂DMSO，试验不同的DMSO浓度和冷冻方法，发现其最佳结果的条件是：5-10%DMSO，快速冷冻、并放在液氮蒸气冷却的Dowar瓶中，使温度下降速度减为-20——50℃／min，在10-15%DMSO下，也能得到很高的存活率。若用慢速冷冻，幼苗都将死去。凡存活组织，经培养后，40-45%可立即长成幼苗。这种比率大约是未经冷冻处理的一半。如果将GA加进无生活力的培养体中，所有材料都会发生形态建成。根据这种现象可得出结论：荷尔蒙对有组织生长的调节，曾为冷冻和解冻步骤而有所改变。
(6)烟草 烟草冷冻实验用的培养基是MS，外加1．0-11．0μMIAA和0．047-0．93μMKIN。细胞悬浮体、愈伤组织或花药都能被冷冻，以DMSO、聚乙二醇和甘油为低温防护剂。最佳结果是10%甘油或0．22M葡萄糖、3%DMSC)和2．5%聚乙二醇的混合物。如用甘油，细胞能在-196℃下贮存6个月而不失活。用三种低温防护剂的混合物，贮藏在-23℃下，只有20%的细胞复活。解冻后的细胞，停留于对数生长期长达4个月。也曾试过速度为-2℃／min的逐步冷冻法。试验表明慢速冷冻法也可以用于烟草和菊属中。
(7)茄 快速冷冻法已成功地用于茄的保存。Grout和Hehshaw(1978)对棱萼茄和Bajaj(1981)对马铃薯都有报道。培养基为MS，外加不同浓度和不同组合的IAA、2，4-D，BA、GA和KIN。以10%DMSO或0．15M蔗糖、5%甘油和5%DMSO的混合物作为低温防护剂。在上述的条件下，茎尖、腋芽或块茎萌芽均能被保存。
经快速冷冻，贮藏46周-24个月后快速解冻，测其存活率，发现三种低温防护剂的混合物要比单用DMSO的效果好，块茎萌芽存活率达11-14%，腋芽和茎尖的存活率为19-27%。存活的组织经对数生长期后，就能再生出植株。
Mix(1981)曾用缓慢生长法，将离体萼片生长在含液体培养基的滤纸上，培养基组成见表13-11。在10℃和4000-50001x下，组织能存活2年，能观察到一些遗传差异。
表13-11 用于马铃薯缓慢生长的培养基
(Mix，1981)
干燥愈伤组织保存法只在烟草的一个品系中获得成功。将双单倍体的克隆HH258生长在含有37．8 μM ABA和0．15M蔗糖的MS培养基上，用无菌空气干燥，然后冷冻在-80℃下36h，再重新转接到新的培养基上后，能重新生长而形成茎叶。
11．杨柳目 美洲杨。与所有木本植物一样，杨树抗寒性很突出。因此，Sakai和Sugawara(1973)用低温保存法。将美洲杨栽培品种的一般愈伤组织培养在含16．1μM NAA的MS培养基上，分不同的温度组：23／19，12／0，8／5，15／12以及0℃。培养25天，经这些预处理后，将愈伤组织冷却到-5℃，然后每日下降5℃，逐步降到-30℃，并保存16h，一部分组织继续冷冻在液氮中2h，在0℃的空气中慢慢解冻。然后将材料在MS培养基上诱导生长50天，接着测定其生活力。所有处理，除23／19组外，在-5℃下都能生存，经12／0和8／5处理的组，能耐寒到-15℃。当愈伤组织再经0℃下驯化20天后，12／0组的愈伤组织能在-70℃或更低温度下存活。
12．龙胆目 咖啡。咖啡种子在低温、低水分条件下保持活力只有4个月到2．5年。因此，就其种质保存来说，组织贮藏是很重要的。Kartha等(1981)用栽培品种Cattarra Rojo和Catuai进行研究。将幼苗的顶端分生组织生长在含维生素B的MS培养基上，附加B5维生素。加0．44-4．4μM BA或0．46-4．6μM ZEA，导致形成单芽，而加22．0-44．0μM BA或ZEA，产生复芽。诱导生根的条件是培养在不含蔗糖的1／2MS培养基上，培养6-8周，90-100%的芽生根。从分生组织再生的芽，作为再生植株保持在人工培养中。26℃、16h光周期、7500lx光强的条件下，可保存2年。在这期间，再生植株的高仅有3-4cm。
13．棕榈目 海枣。热带棕榈树，海枣能否进行冷冻保存。Finkle等(1979)和Ulrich等(1979)曾研究过。
14．禾本目 黑麦草。Nitzsche用愈伤组织干燥法对毒麦进行试验。愈伤组织生长在含有11．3μM2，4-D的B5培养基上，其中分别含有0．06，0．15和0．35M蔗糖和0，0．37，3．8，37．8μMABA，进行16天的预处理。干燥7天后，把愈伤组织移回原来的培养基上，发现有51-96%的愈伤组织开始重新生长，与培养基变动无关，但没有一种处理能再生出植株。
Dale(1980)对多花黑麦草的茎尖培养体采用缓慢生长法，在加有0．93μM KIN的MS培养茎上，幼苗能从贮藏在2-4℃，每天3001x／8h的条件下的芽上再生植株。一年后，将再生植株至25℃下，再生率为67%。
(1)稻 Sala等(1979)用冷冻法研究热带禾本科植物水稻。用栽培品种Ronsarolo作为悬浮培养体的材料，培养在Ohira等(1973)的R-2培养基上，细胞经DMSO和甘油处理后，放入保温瓶(Dewar瓶)中，然后在-70℃下保存18h。快速解冻后，用TTC法测验生存率，经5%DMSO预处理后的存活率为58%，而干重的增加与未经冷冻的相同。试验结果表明甘油和其他浓度的DMSO都不能适用。
(2)玉蜀黍 Withers，(1978)以玉米为材料，做过逐步冷冻法和干燥冷冻法试验。后者是用于成熟和未成熟的合子胚，这些试验都获成功，但未报道存活率。
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