调味剂的生产
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第315页（9979字）
(一)前体的供应
虽然一般认为在组织培养中，细胞具有次生代谢途径的潜在能力，但与正常植株相比，组织培养的细胞降低了这种能力。至于为什么如此，则很少有这方面的基础研究。Overton和Picken(1977)大略陈述了在组织培养中，只有极少的已知因子抑制了次生代谢合成，或者到再分化时再引起它重新合成。Zenk(1978)举了许多例子来支持这一观点，人们可以猜想合成途径的阻碍是由于分化中的一个或几个中间物所引起。将中间物加到组织培养的营养培养基中，但这一研究方法已证明难以成功，除非中间物在代谢途径中的位置正好接近于最后产物。
辣椒的佐料化合物——辣椒素是从缬氨酸和苯丙氨酸合成的，从二途径得到的辣椒素的直接前体是8-甲基壬烯，它与异己酸和香草胺相似。这样，供给异己酸和香草胺，以提高辣椒素的合成水平。并认为可以超过原来以氨基酸为前体的合成水平。前体的联合使用可以证实是否从苯丙氨酸到香草胺或从缬氨酸到异己酸。实验表明，只要异己酸存在，辣椒素就产生，但若仅有缬氨酸供给，则辣椒素产量就大大地下降。这证明辣椒素产生的速度取决于缬氨酸到异己酸这一步。
洋葱组织培养，速度限制步骤的决定与上述相似，洋葱的佐料化合物是从三个前体：S甲基和S-丙基-L-半胱氨酸氧化硫以及异丙烯基半胱氨酸氧化硫亚砜，当组织被切割或压碎提取各种挥发性调味剂时，它们通过一个蒜氨酸的作用而氧化，S-甲基和S-丙烯基半胱氨酸氧化硫亚砜是从赖氨酸形成的，但主要前体S-异丙烯基半胱氨酸是从缬氨酸和半胱氨酸合成的。从缬氨酸到中间物异丁烯酸的合成途径，是原来代谢顺序的一部分。异丁烯酸与半胱氨酸连接形成(S-2-羧基丙基)半胱氨酸，这个次生代谢途径的起动很大程度上受葱属种的限制，它决定了硫化异丙烯基半胱氨酸和最后的主要前体。初级途径的中间物，如硫酸盐、缬氨酸、异丁烯酸和半胱氨酸提供给洋葱愈伤组织，却没有调味剂物质前体的产生。但当次生途径中的中间物即(S-2-羧基丙基)半胱氨酸和硫化异丙烯基半胱氨酸存在，就有主要前体的活跃合成。认为愈伤组织中阻碍前体合成的地方，是在次生代谢途径开始时，异丁烯酸与半胱氨酸连接的步骤。
用放射自显影法标记中间物，发现香草和洋葱利用初级途径的早期中间物，如C14-缬氨酸(香草)、C14-半胱氨酸(洋葱)，一些放射物质在辣椒素和洋葱佐料物质的主要前体中出现，这说明组织培养中次生代谢也在进行，不过是在极低的水平。然而，当培养中供给中间物，无论是初级途径或是次生代谢的早期阶段，次生产物的合成没有明显增加。这使我想到，阻碍合成可能有两个因素：(1)初级中间物，或次生途径的早期阶段，很可能走向了其他途径，而不进入次生代谢途径；(2)决定中间产物进入次生代谢途径的关键酶，在不分化培养中可能失活。因此，在速度限制进行到一定步骤后，将中间物加入培养基，就能刺激最后产物的合成，但这一阶段之前将中间物加入，则不行。
在未受损组织培养细胞中，关键酶活性降低的证据是由Banthorpe等(1976)提出的，他们比较了从14C标记前体异戊烯磷酸酯单萜合成，用的是从愈伤组织中获得的游离细胞和艾菊的完整植株。愈伤组织中提取的酶系统活性比植株中的高，但愈伤组织中这些单萜还没有达到可检出的水平。单萜生物合成所需要的酶，虽然在愈伤组织中已出现，但是失活的或被阻抑的。有一种酶对于另一种佐料化合物多酚有调节的作用，这就是PAL(苯丙氨酸解氨酶)，在培养中，多酚合成发生在生长周期的末了，多酚的出现总是伴随着PAL活性的增强，决定调节酶活性的因子还需要进一步地详细分析。
(二)培养基的组分
另一个克服组织培养中次生代谢合成受阻抑的方法是变化培养基的成份。这一方法的设想根据是：代谢途径可能被：(1)特殊效应的生长调节物质在次生代谢途径的一定步骤才释放；(2)非直接的效应，它免除了中间物提供的极限，此中间物是由活跃的初级代谢产生，而后活化。通过增加培养基中的基本营养物，或者降低培养物生长速率，以限制初级途径的要求，以增加可利用的中间物的提供。
芹菜中香精油含有主要的调味剂化合物四氯苯酞，其中3-异丁基烯-3a，4-双氢苯酞，3-n-丁基苯酞，以及瑟丹内酯是最重要的。在不分化的芹菜组织培养中，研究生长素和细胞分裂素不同处理的效应，发现用IAA代替2，4-D得到一个低水平的佐料产量。用2，3-和3，5-二氯苯氧乙酸(即2，3-D和3，5-D)，3，5-二甲基苯氧乙酸和异氯丁酸代替2，4-D，则刺激了佐料产物的大大提高，而氯基苯氧乙酸是无效的。所有这些处理，除2，4-D和氯基苯氧乙酸使培养物产生绿色团状结构外，3，5-D则促使产生高产量的佐料物质和绿叶。由此可见，对佐料产量影响的生长变化因子，若离开形成绿色的分化效应来讨论是困难的。
香草的组织培养，培养基中提供的大量元素减少到抑制生长的水平，则有刺激辣椒素的合成作用。培养物培养在营养丰富的培养基中，供给正常氧的5%，不供给蔗糖，则在组织和培养基中可以检测到辣椒素，当强化培养基同时加入中间产物乙烯胺和异癸酸，辣椒素的合成进一步增加到与完整果实中浓度相当的水平。对于生物碱来源，生长与次生产物形成之间同样有反比关系，这现象已引起注意。
(三)形态学和细胞分化的作用
Constabel等(1974)对组织培养中次生产物形成的早期观点阐述认为，无论何时合成和积累次生产物，都依赖于植物细胞中特殊生物化学和结构上的饰变，除非那些饰变是能够被诱导的。已经知道，香精油和佐料化合物积累是在植物的特殊组织内如薄荷的脉体、芹菜的油管、洋葱肥大的叶基。组织培养中香精油和佐料物质形成的研究已表明，完成油和佐料物质的合成仅仅当培养物有形态上的分化，如产生茎、根时，才能发生，或者培养中已包括了特殊细胞的生长。Becker(1970)发现，不同的香草植物组织培养，都没有香精油的合成，直到培养中有了形态上的分化才能合成上述物质。同样，不少研究者也证明，洋葱组织培养中，分化出根和茎是洋葱调味剂产生的基础。Al-Alta等(1979)在芹菜组织培养中，发现胚状体发生是芹菜调味剂物质产生的基础。
某些组织培养能产生香精油，但检测总是发现有特殊细胞或导管的存在或处于很慢的生长速率，例如芸香培养物能产生香精油，这与整体植株中形成情况相似，但是特化的裂生的产油通管只在分化的植物中才能存在。紫苏的组织培养也合成香精油，可能因为细胞团在悬浮状态，其内有细胞的分化，或者细胞生长速率较低。Townsley(1974)发现，生产可可香需要可可悬浮培养物开始衰老才行。产油的薄荷培养也要包含部分分化的细胞。以后在胡椒、薄荷培养物产生香精油的研究中，发现得到的油的组分与植物中得到的不同。在这些培养中油是从愈伤组织中一些特殊的脉体细胞来的，黑蓍草培养物在光下仅有变绿和形态上分化，也只有在这种光生长条件下，培养物才有与植物相同的香精油的产生。在所有这些通过组织培养得到香精油的情况中，在合成和积累次生代谢物之前，认为必需要有细胞和器官的分化，在次生代谢途径活化之前，细胞需要达到特定的分化阶段。
在芹菜组织培养生产调味剂物质中，研究了组织分化状态对起动这些物质合成的效应，同时分析其不同分化状态时的产量差异，包括分析不分化的细胞：球形、心形、鱼雷期的胚和已分化的植株。早期的球形胚和心形胚不产生调味剂物质，而有叶绿体和内部细胞分化状态的鱼雷期胚，则含有四氯苯酞佐料化合物。但此时没有油管结构存在，所以说明香精油中佐料化合物的合成并不依赖于特化细胞类型的存在。然而，鱼雷期胚是绿色的，有可能佐料的合成与绿色有关。
芹菜叶柄培养中，绿色对佐料产生的效应显示出正相关(表14-13)，随培养基成分的改变，芹菜组织就开始变绿，也可以通过选择绿色克隆的办法。通过用一系列苯氧乙酸来代替2，4-D，可以诱导发绿，最有效的是3，5-D。所有绿色的组织都有芹菜香味，能保持绿色克隆的培养基的分析显示了四氯酚酞的存在(图14-17)。绿色芹菜细胞团的光学显微镜的研究发现，没有能产生器官的分生组织或胚状体结构。在电镜下，发现绿色和非绿色的培养细胞中的淀粉粒没有明显的区别，但是细胞中叶绿素的存在使得叶绿体发育完全，尽管这一作用对四氯苯酞合成所起的作用还不清楚。绿色也刺激生物碱的生产，所以质体的变绿很可能仅仅是全面细胞分化的一种表现，随着这种分化，增强了生物合成的能力。
表14-13 叶绿素和四氯酚酞的相关性
图14-17 芹菜种子油，叶组织和含芹菜绿色组织培养物的营养培养基的抽提物的GC图谱
1．种子油=0．02g鲜重2．香草油=1g鲜重3．绿色无性系培养基抽提物=0．2g鲜重a=
烯，b=苎烯，c=石竹烯，d=倍半萜烯，e=3-丁基酚酞，f=瑟丹酮酐
(四)产量的提高
若培养物的次生产物合成有一个极限，则就有可能利用组织培养中天然的遗传性的差异选择产量最高的培养系，有些方法已经成功，特别是用一些药剂处理。
1．检测化学制剂存在的最灵敏的方法之一是放射免疫法(RIA)，这技术Weiler(1977)已作了详细叙述。这一方法是理想的，因此这一技术在药物和药理学上的应用有大量的文献。同时，这一技术迅速而灵敏，因此可以对小样品作许多次测定。有可能发展RIA系统来示踪许多感兴趣的化合物。
2．选择更简单、直接、灵敏的RIA方法来作筛选。组织培养的克隆可以利用其基本的气味来作估计，因为鼻子是非常灵敏的。如果产量与颜色相关，比如食物颜料的生产，筛选是直接的。同样，如果合成与绿色成比例，则绿色程度可作为筛选的一个指标，一般的色谱法定位出来的区域宽度对筛选细胞粗提取液中的生物碱是有用的，可直接浓缩在色谱层析带上。对细胞压片中萜的示踪可能发展相同的技术，因为这些化合物的出现，很好显示了细胞具有合成相关调味剂化合物的能力。
3．筛选的直接方法消耗劳动时间，包括许多样品的分析。尚未研究而可能选择的一个方法．是选择细胞对培养基中类似物的抗性反应，可选择对培养基中氨基酸类似物有抗性的细胞克隆，可能由于某种特殊氨基酸的过量生产而有一定的抗性反应。这方法可能要先确定次生代谢中间物的类似物，然后选择对这些类似物出现有抗性的细胞，理论上，通过提高次生代谢的活性将获得抗性，由此来提高次生物质的产量。
(五)洋葱调味剂产量预测方法
1．洋葱调味剂前体的薄层层析和电泳法 薄层层析和电泳是分离氨基酸和调味剂前体化合物的一个快速的方法(图14-18)。
(1)100mg鲜重的组织培养物放入匀浆器，其中含有2cm3甲醇／三氯甲烷，(12+5十3v／v)(MCW)水，在-20℃下放置30min，然后匀浆。
(2)过滤匀浆液，用小的梯度离心管高速离心。
(3)上清液移至另一离心管，残物再加2cm3(MCW)混匀，离心，将上清液加到第一个提取液中。
(4)提取液中加1cm3氯仿和1．5cm3水，并用涡流混合器混和。
(5)15min高速离心分离两相，上层的水层转移到50cm3梨形烧瓶中。
(6)在不超过30℃的真空烘箱中干燥，然后贮藏在-20℃下。
(7)将提取物质溶解在10%异丙醇，浓度达到400mg鲜重／cm3。
(8)15g纤维素粉+2．5g硅胶H+100ml蒸馏水，使它们混匀30s，然后将混合物静止30s，再混和30s，再静止60s，然后铺到无油脂的玻璃平板上(4mn，20×20cm)，使其厚300μm，装上TLC外套。
(9)用相同的l0-20mg鲜组织，用微吸管点到平板上，成2．5cm长，2．5cm宽的薄层，将标记氨基酸：(2，4-D-)-1-赖氨酸盐酸化合物点在开始点上(图14-18)。
图14-18 高压电泳和层析双向分离氨基酸的程序图
(10)平板上喷以电泳缓冲液(pH2，15．3ml98-100%的甲酸，57ml乙酸，溶于11蒸馏水)，用层析纸通过吸墨平板将多余的缓冲液除去。
(11)将板放在Shandon电泳槽的水冷却基板上，起始处在正极，缓冲液浸泡的层析纸的折叠带放在板的两边，用玻璃条和玻璃板固定，这样保证纸带与薄层之间的良好接触(图14-19)。
图14-19 电泳装置图解
(12)电泳在1000V和20-40mA下约25min，直到黄色的标志点到达4cm刻度处，以保证在20×20cm平板上氨基酸有最适的电泳分离带。
(13)在冷空气气流中干燥干板，用水冲洗，再干燥。
(14)平板在同一方向上显色两次，第一次用甲基乙基酮／吡啶／水／乙酸(70+15+15+2，v／v)，然后用n-丙醇／水／n-丙基乙酸酯／乙酸／吡啶(120+60+20+4+l，v／v)，所有的溶剂要纯。使用之前在层析箱内使其饱和1h。
(15)用0．2%茚三酮(溶于丙酮)喷洒并干燥平板，可在室温过夜，使其进行显色反应。
(16)所有的平板要复制和记录，即用纸画下或拍照其显色谱。
(17)用标准的氨基酸在同等条件下也得出一个图谱。
2．总的食用成分前体的检测 半胱氨酸亚砜碱(食用成分前体)和蒜氨酸酶之间反应的初级产物之一是丙酮酸。因此，测定丙酮酸可用来确定总的前体物质的水平在组织培养中的状况，丙酮酸的测定点根据Schwimmer和Gnadagni(1962)的方法，这个方法对于丙酮酸的内源水平(Pc)和组织分解的丙酮酸水平(PT)的测定都适用。
(1)PT的测定：2．9g组织用研钵磨碎，加2．5m10．1M焦磷酸钠缓冲液，pH9．0，室温下静止30min。
(2)组织匀浆加25ml蒸馏水稀释，用滤纸过滤。
(3)再为Pc测定：最初的组织匀浆在2M HCl中保持，以防止酶的活动。
(4)每次过滤2ml溶液，加1ml 0．0125%2，4-二硝基-氢化锌，保持于2M HCl中。
(5)在27℃中放置10min，加5ml0．6M NaOH，在420nm波长测定浓度(消光值)。
(6)用丙酮酸钠的标准溶液作标准曲线，最大值至2μg／ml。
(7)用μmol丙酮酸／ml来表示结果，或者过滤中测定蛋白质，以特殊的活性μmol／mg蛋白质／min表示结果。
(8)蛋白质测定：振摇过滤得到的已知的很小体积的物质，加25倍冰醋酸，将混合物高速离心，这样将蛋白质沉淀。
(9)弃去醋酸，再将蛋白蛋溶于已知的2%碳酸钠(溶于0．1M NaOH)溶液。
(10)用Folin Ciocalteau法测蛋白质含量。
(11)用牛血清蛋白(其浓度范围为10-100mg／l来作标准曲线，以mg蛋白质／ml表示结果。
3．蒜氨酸酶提取及其活性检测
(1)10g组织用研钵匀浆，加10ml0．2M磷酸钾缓冲液，pH6．8(溶于0．3M蔗糖)，作用2min，然后用五层平纹细布过滤。
(2)滤液在MSE超速离心机上，以3500×g离心15min，上清液在30000×g再离心20min，产生很清晰的黄色上清液。
(3)上清液中可溶性蛋白，以固体硫酸铵加到75%饱和液，使之沉淀下来，在4℃下摇动4h，然后混合物在30000×g下离心20min，得到的小球贮藏在-20℃下，用以分析。
4．蒜氨酸酶的活性检测 这是Schwimmer和Mabelis(1973)方法的改良法。是以S-丙基-1-半胱氨酸亚砜作为底物。
(1)蒜氨酸酶活性检测中二个蛋白质的浓度大约是0．1和0．05mg／ml。
(2)反应混合物包括0．4m／50mM S-丙基-1-半胱氨酸亚砜，0．1m／0．5mM磷酸毗哆醛，0．4m／0．1M焦磷酸钠的缓冲液pH9．0和0．1ml样品。
(3)混合物放置在25℃水浴中，在不同时间加入0．1ml样品，以加入1ml10%TCA来中止反应。
(4)每样品取2ml，以前面相同方法测定丙酮酸。
(5)结果以活性mg／蛋白表示。
5．从整体芹菜或悬浮培养液的过滤细胞中提取食用成分
(1)50g芹菜(鲜重)加50ml乙酸乙酯，用旋转式匀浆器匀浆。
(2)加75ml蒸馏水，充分混合，轻轻倒入500ml球形烧瓶加入少许抗震颗粒。
(3)匀浆液在Stahl(1969)装置中蒸馏12h，每2h将蒸馏物收集入一个带箔帽的烧瓶中。
(4)饱和的水状馏出物用氯化钠和乙酸乙酯来分配提取。
(5)水相中留有的物体再加三次和它等体积的乙酸乙酯，充分混合，再分离。
(6)收集乙酸乙酯，用无水硫酸镁干燥(每100ml乙酸乙酯加0．5-1．0g MgSO4)。
(7)过滤和在真空下蒸馏至100-200μl。
(8)用气相层析分析0-10μl提取物(在Pye105气相层析仪上配上9ft×4mm玻璃柱填充物：10%SP2100置于60-100目分子筛上，载气为氮气，流速为60ml／min，温度以6℃／min使达60-250℃。
(9)酚酞水平可从GLC、峰面积估算，和以相当于纯酚酞标准表示之。
6．从悬浮培养物的培养基中提取取120ml培养基加50ml乙酸乙酯，充分摇匀以后步骤同上述3-8。
7．叶绿素提取
(1)1g鲜重芹菜加入3ml80%丙酮，在研钵中磨碎。
(2)匀浆倒入50ml离心管，1500×g离心3-5min。
(3)弃去上清液，重复1-2步骤，直到丙酮中无绿色。
(4)收集上清液，记录体积。
(5)乙酸乙酯提取液的一部分在分光光谱计上，以663nm和645nm测定吸收峰。
(6)计算叶绿素含量，根据Arnon的公式
mg／cm3叶绿素a=0．0127D663-0．00269D645
mg／cm3叶绿素b=0．0229D645-0．00468D663
这里D663和D645分别是663nm和645nm的吸收值。
【参考文献】：
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