玉米
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第379页（16229字）
玉米(Zea mays L．)是驯化的一年生种，属禾本科Maydeae族。雌雄同株。雌花序长于侧枝顶端，产生400-1000胚珠。雄花序位于主茎顶端，约有10000花药，每株随风散发约2×107花粉粒。花粉∶胚珠约20000∶1，保证有效授粉，高效异花授粉。生命周期高度多样化，典型约为100天。
玉米的祖先说法不一。大都接受“大刍草学说”(teosiate theory)。认为玉米直接从大刍草或从大刍草与同族(Andropogeae)的某些未知种杂交产生。另一观点，认为荚果玉米是其祖先类型，掺入大刍草，为现代玉米进化有所贡献。果穗外被许多谷皮叶，阻碍种子散布，使得现代玉米种不能在野生状态下生存。
玉米是永久异交作物，以高度遗传异质性为特征。地理分布广阔，产生了许多亚种，各自适应于不同生长条件自然地理亚种可分为爆裂种、燧石种、粉质种、马齿种和甜玉米，是以籽粒胚乳性质命名。1900早期开始自交育种，从18世纪自由授粉马齿种产生大量自交系。由此其遗传变异性得以控制和系统研究，开发了遗传学和细胞学研究。目前在其10个染色体上已定位了350位点，决定着颜色、化学组成和发育特性。还有600位点尚待定位。
育种目标可分三类：产量，增高育种群体的加性变量和评价杂种组合；环境(高温、寒冷、干旱、淹水，盐)基本上是水分亏缺和植株水分经济改进途径；病虫害，举其要者有秆腐病，南方玉米白叶枯病，对含有德克萨斯雄性不育细胞质的玉米杂种的病原菌新小种。
玉米不仅有巨大经济重要性，也是充满潜势的遗传材料，当前，植物细胞生物学者的任务，将是寻找应用于植物育种的组织培养有用观点。
(一)玉米组织培养进展
La Rue(1947)开创了玉米组织培养，试图连续培养玉米胚乳。1979它终于建立了长期培养体，并用黑墨西哥甜玉米和其它甜玉米为标准供试材料。当Shannon与Batey(1973)取得了马齿种自交系A636和R168培养体时，1970年粉质胚乳培养体首先取得成功。Reddy与Peterson(1977)用经回交法把wx-m8渗入R168取得腊质胚乳培养体。这些成果指出遗传变异对组织培养的反应，Tabata与Motoyoshi(1965)首次研究了它们遗传基础。以后研究指出常用的培养条件与选择适宜基因型相比，对改进玉米组织培养的特殊反应占有次要地位。
印度国立化学实验室1964开始的试验，建立了几种重要禾谷类包括玉米的连续繁殖的组织培养体。用幼苗芽切段接种在广泛培养基上，启动培养体。Mascarenhas等，(1975)和Hendre等，(1975)观察，首次提出用分化的禾谷类组织培养时，迄今仍能看到的线索：(a)培养体只有根的增殖，很少见愈伤组织细胞系；即使出现也非形态建成的。(b)因此，将启动的培养体浸入液体培养基，没有可能取得悬浮培养体。(c)不同禾谷类组织培养体生长和行为不同，玉米最不满意。(d)除非启动的外植体带有茎尖，培养体不生芽。用各种外植体：未成熟雄穗分生组织，软化的吸涨的成熟胚，幼苗茎切段，成熟胚和茎尖培养结果相似。Mott与Cure(1978)，Cure与Mott(1978)和King等(1978)首次深入测试了典型玉米培养体性质。
1975发表了二篇论文，涉及玉米组织培养的二种新极端。(1)Sheridan(1975)用黑墨西哥甜玉米幼苗茎切段建成了高变分散的液体悬浮培养体。这种培养体适用于植板试验，产生分裂中的原生质体，但非形态建成的。与此同时，用B73，F71和G155×C103也取得了相似培养体。(2)Green与Phillips(1975)报道了常规方法产生玉米组织培养体，能以再生植株。这些培养体是用特定时期未成熟胚盾片为外植体的，能经许多月继代，而不失其再生能力。又一次几种供试基因型中，只有特种如自交系A188产生了形态建成的培养体，以后用几百种玉米自交系测验指出复杂反应。组织学观察这类玉米培养体和研究其它禾谷类(例如高粱)提出这些培养体是不定地增殖的胚、芽和根的复杂混合体。它们的植株再生过程与烟草植株再生的经典系统不同，后者是从未分化细胞群体，在改变培养基的荷尔蒙浓度后，产生有组织化分生组织。
尽管有复杂性和其再生植株是从已有的多细胞结构产生，这类培养体曾用于选择玉米抗性突变体，取得成效。继续研究“烟草类型”形态建成的禾谷类培养体。曾有报道狼尾草属和水稻通过体细胞胚胎发生，从生长很快，未分化培养体生长在液体培养基里的细散悬浮体，分化再生植株。最近Gordon和Green观察到这种组织培养体。Ziyi等(1981)也取得了从玉米花药产生的胚胎发生的单倍体培养体。
Potrykus等(1977)报道了禾谷类植株(玉米)组织分离的原生质体诱导产生了持续分裂。但黑墨西哥甜玉米细胞培养体的原生质体能常规分裂。目前许多实验室用细散胚胎发生的悬浮培养体诱导原生质体分裂。
玉米产生单倍体组织不存在特殊问题。已有带有适合标志的细胞遗传系统(详见King等，1978)，未成熟胚用于分离形态建成的、单倍体培养体方法已有描述。近十年来，玉米花药培养成果巨大，但只用了少数有反应的基因型。究竟是花药因素或培养基决定着这种反应，还不清楚。例如Ting等(1981)发现中国杂种唐山91的花药，约有17%产生愈伤组织和胚状体，50%以上愈伤组织再生单倍体植株。
(二)培养程序
1．人工培养授粉与胚珠直接授粉
(1)抽丝前用纸袋套玉米雌穗。植株应分植，花药裂开前割去雄穗。
(2)抽丝后取下雌穗，立即割除伸出的花丝。每次除去谷皮一片，用乙醇90%(v／v)仔细擦洗最后一层谷皮。
(3)在无菌条件下，除去最后一层谷皮，将花丝切成长1-2cm。
(4)横切雌穗厚2-3个颖果的小片(图17-2a)。每片径向切成有4-6颖果小块(图17-2b)，切去穗轴组织，呈平底状(图17-2c)。
(5)将穗轴向下插入琼脂固化培养基，放入直径9cm培养皿内，花丝向中央叠置(图17-2d)。培养基成分不是关键。Green与Phillips培养基(1975)不加荷尔蒙，蔗糖增高到5%(w／v)，曾取得成功(Dhaliwal与King，1978)。
(6)握住新裂花药放在向心排列的花丝上方，用针梳理以释放花粉。花药的任何部分必需不接触或掉进培养皿。
(7)将培养皿放在25-30℃，暗培。
(8)成熟种子取得高频率(至少50%)。
(9)对玉米胚珠直接授粉，在花丝插入下方的子房壁切除，除去帽状组织，使核仁暴露(图17-2e)。按上法授粉。
图17-2 试管授粉和颖果培养用母穗制备各阶段
(10)直接胚珠授粉的有效培养基是B11〔Norstog，(1973)和Green与Phillips(1975)〕，附加400mg／1 CH和28．9μM GA。
2．从不同外植体诱导愈伤组织培养物 无论基因型为何，幼苗芽(茎、叶)或根外植体相对易于产生“生根型”培养体。可是，只有少数基因型(见玉米愈伤组织培养的进展一节)可能建成松散细胞培养体。
(1)用次氯酸钠(2．5%w／v加几滴清洁剂)表面消毒干种子15min，强烈振荡，无菌蒸馏水淋洗3次。(0．01%w／v氯化汞也有效)。
(2)将经表面消毒的种子放入无菌蒸馏水中(水深刚能盖着种子)振荡过夜。
(3)重复步骤1。
(4)种子分开接种在无荷尔蒙培养基上(约5ml)，放在150×25mm培养皿中。
(5)光下发芽5-6天，直到幼苗达3叶期。
(6)取幼苗第一节上方1cm切段(图17-3)，切成厚1mm小片。
图17-3 用幼苗芽切段启动组织培养体
(7)接种5-10小片在培养基上(约10ml)，装在直径6cm培养皿内。
(8)将初生根切成1-2cm外植体用于根培养，接种5-10段在培养基上。有些基因型向根尖部分的反应可能降低。
(9)光培(约2000lx)，25℃。普遍用Green与Phillips(1975)改进的MS培养基。
3．未成熟胚
(1)进行控制授粉。
(2)胚达到培养要求的大小所需时间，因基因型和生长条件而异。
(3)仔细地反摺谷皮(不要剥离)或纵剖全部谷皮露出已授粉的穗，观察胚的发育状态。各个地取下颖果呈钝头压舌板形。经实践取得经验，有可能从植株上很快取胚(图17-4)，测定其大小。以清浙可见为正确大小(约0．5-1．5mm)。
(4)用上法取得适用颖果，不伤果皮和擦掉附着的护颖。
(5)把颖果放入次氯酸钠溶液(2．5%w／v加几滴清洁剂)，强烈振荡10min，表面消毒。除去消毒剂，用无菌蒸馏水淋洗3次。在无菌条件下，通过接在液体排泄弯管上的无菌吸移管，通到真空泵，最易除去废溶液。
(6)保持无菌颖果潮湿，放入无菌容器，每一次取一个颖果转到无菌培养皿盖上，供解剖用。先在低倍解剖镜下用70%乙醇擦，放在超净工作台上。在皿底放一块琼脂以防滑动。
(7)这个时期的胚处在胶质状胚质上，朝向颖果基部，其平直面压着穗轴(图17-4a)，把颖果圆面向下，用尖头镊子安放好正确部位。用细尖解剖刀平行纵切，和在胚上方切去一段颖果(图17-4b)。从解剖刀尖上取胚，转入培养基。
图17-4 胚在未成熟颖果中的位置
(8)为了诱导盾片增殖，将胚以胚胎发生轴(在平直面上)向下接种在琼脂固化培基上。最普遍采用Green与Phillips(1975)改进的MS为启动培养基。用大小相似的胚，放在不加2，4-D培养基上发芽，由此可缩短玉米的世代时间。用标准培养箱灯光5000-10000lx照光。
(9)盾片反应视基因型和胚最适大小有相当差异。最好情况下，复杂组织培养体，2-3周内，胚大小比接种时增长许多倍。
(10)每隔2周，选择小块愈伤组织转移到新鲜培养基上。当逐步除去2，4-D时，例如从9．0μM到0．9μM到零，培养基上的茎芽或胚将成熟，并产生小再生植株。这些再生植株常有分蘖，在培养基上正常生根，可转移到琼脂培养基培养皿。再生植株高4-5cm时，洗去根上琼脂，移栽光照、湿土中。在第一周盖以玻璃烧杯，逐步除去。
4．未成熟花序 禾谷类包括Triticum(Dudots等，1975)，Sorghum(Brettell等，1981)和玉米(Rice等，1979)培养的花序，报道过再生了植株。这是有价值的和潜在很有用的，至少高粱是从体细胞胚胎发生再生植株的。R．Brettell(私人通讯)认为这种方法未能广泛用于玉米，反应一般不好，尚无可供推荐方法。下列程序不是指导性的，是鼓励大家试用的。
(1)从具有长40mm未抽雄植株剥去外层叶。用90%(v／v)乙醇擦最外层幼叶，无菌条件下取出花序。
(2)将穗轴切成约5mm长小段，接种后培养皿里的培养基上。用Green与Phillips(1975)改进的MS。也可试用培养高粱花序的Brettell等(1981)再度改进的培养基。
(3)最适反应视花序成熟时期而定。
(4)反应最好的外植体，产生增殖中的盾片状组织，其中有些像正常合子胚，有明显的根和茎轴。可是类胚结构很快长成芽和根的复杂团块。各个再生植株可以分开，培养到成熟(见未成熟胚节)。
5．幼叶和叶原基 Wernicke与Bretell(1980)证实高粱叶原基产生体细胞胚，是与成熟禾谷类叶片对人工培养完全不发生反应完全相反。幼叶将是胚胎发生培养的有用给源，这是只有未成熟胚正常取得(见上述有关讨论)。现在尚无适用于玉米产生胚胎发生培养体的工作原生克隆，下列程序可用于测验玉米基因型的潜力。
(1)用灭菌的种子制备无菌幼苗(见前，从不同外植体启动愈伤组织培养节)，放在玻璃管(150mm×25mm)内的无荷尔蒙的琼脂固化培养基上。培养在25-27℃，光强2000-50001x。
(2)在茎尖分生组织上切取芽，将上部切成1-2mm小段。在低倍直视显微镜下将各叶展开，接种在琼脂固化培养基上(见前节)。
(3)幼叶小片可能长成增殖的愈伤组织培养体。如用叶鞘与叶片间分化前的最幼叶，全部小片组成一个培养体。较老叶叶片未曾产生培养体。
(4)最幼叶的合意反应是产生不定芽和体细胞胚胎发生(见前节)，但这视供试基因型而定。
6．胚乳培养 基因型和胚乳发育时期是影响外植体反应的最重要因子。供试材料应仔细进行授粉，记载授粉日期。
(1)收割授粉后7-10天穗，将带谷皮穗带到实验室。
(2)用手仔细除去全部谷皮和花丝，不伤籽粒或产生不需要的侵染。将穗横切为2。
(3)用20%次氯酸钠表面消毒去壳穗20分钟，放在大、无菌烧杯中，无菌蒸馏水淋洗3次。
(4)此后全部操作在超净工作台上进行。
(5)用手指抓住穗的末端，用解剖刀切取顶部籽粒，每次10-20粒。
(6)用镊子仔细舀出胚乳，保证无母体组织接触在胚乳上。
(7)接种4个胚乳在Straus培养基上(10m1)，装在直径6cm培养皿中。
(8)暗培，25℃。
7．原生质体分离和培养
(1)用玉米植株 多年来用禾谷类植株组织广泛试图分离和诱导原生质体分裂，只有一次成功报道(Potrykus等，1977)，未能重现。因此无成立的方法。兹将玉米茎原生质体成功试验的要点述之如下。这是的确值得重复的。
①取成熟玉米植株(刚抽雄前)(约8周)，将叶全部除去。
②用HgCl20．01%w／v加少数几滴清洁剂，表面消毒茎10min，无菌蒸馏水洗，将切段接种在小体积培养基上(P2／mod，potrykus等，1976)，装在无菌培养皿内。
③将茎切片(厚0．3mm)放入培养基，放置30min。
④将撕碎的茎(约2克／30ml溶液)放入下列酶溶液：纤维素酶(Onozuka R10)0．2%w／v，果胶酶(Roehm，Damstadt)0．2%w／v溶于p2／mod，pH5．8，暗培，12℃，继之32℃6h。
⑤轻度振动培养皿，用筛网(100μm)过滤混合物。
⑥经溶液：CaCl2(0．24M)=1∶2稀释后，将这种原生质体悬浮体离心，20×g，5min。
⑦用2体积0．24M CaCl2：1体积p2／mod洗沉积的原生质体，再离心。
⑧除去残碴，在0．54M蔗糖(5份)+p2／mod(1份)缓冲器上收集原生质体，离心40×g。重复收集2次。
⑨用离心法20×g洗一次，洗液是0．24M CaCl2(2份)加P2／mod1份，再悬浮在P2／mod中。
⑩全部溶液应调整到650mOS／kg水，pH5．8。
采用Potrykus等(1979)MDA技术，在广泛条件下培养原生质体。供试组合的50%记载到分裂，群体密度为5×103／m1，23．0μM2，4-D，12．3μM吲哚丁酸，12℃，24h，22℃14天，继而培养在27℃，常用暗培，取得最好效果(形成愈伤组织的占接种原生质体的约5%)。35天后，培养基诱透性降低到360mOS／kg水。这种试验结果，培养体仍有存在，生长在悬浮体中，加倍时间约20小时，但未见形态建成的。
(2)用玉米细胞培养体 玉米和其它禾谷类和许多双子叶种一样，从特种类型细胞培养体分离的原生质体将立即分裂和再形成继续增殖的培养体。供源细胞培养体特征是加倍时间短；同质的、小、细胞质浓的细胞；无组织化组织和器官；悬浮培养体中高度松散生长良好(见玉米组织培养进展节)。禾谷类产生这类培养体的频率，较双子叶的为低。下述原生克隆对玉米自交B73产生的细胞系是适用的。
①有规律地在悬浮体中培养细胞，培养基的渗透性与继后所用的酶溶液的相同。每个培养体必需测定最适于原生质体分离的细胞周期的时期。长期建成培养体成果最好。
②用离心法收集细胞，用新鲜培养洗，悬浮在酶溶中：纤维素酶(Onozuka R10，Kinti Yakult，Nishinomiya，日本)1%w／v，果胶酶(Roehm，Damstedt，FRG)0．5%w／v，半纤维素酶(Rhizopus，Sigma)0．5%w／v，甘露糖醇0．2M，CaCl2 80mM，MES缓冲液0．5%，渗透压440mOS／kg水，pH6．0。
③放在往复振荡器上轻轻摇动1h，24℃。
④沉降(约100×g)，除去酶混合液，换以1／10稀释液(调节CaCl2浓度，达到保持渗透性为常数)。
⑤放在偶而轻度旋动下培养1-2小时。80-90%细胞变成原生质体。
⑥用筛网(50μM)过滤，用反复离心法洗原生质体(50×g，5min)，用渗透溶液0．5M甘露糖醇(3份)，0．2M CaCl2·H2O(1份)，0．5%MES，pH5．8。
⑦转移到渗透压保持恒定的培养基，或是液体薄层培养或软琼脂植板。至少有约30%原生质体分裂一次，约10%持续分裂。
⑧还没有可供推荐的培养基。在供试常用27个培养基中，用B73玉米细胞系为试材，其中13个发生分裂。发现一个最适宜的2，4-D浓度(9．0μM)和最适原生质体密度(5-9×104原生质体／m1)。
⑨广泛改变分离和培养条件，结果并无显着改进。
8．器官培养
(1)胚 分离玉米未成熟胚技术已如上述。最近62年来，用过许多培养基用于玉米胚培养，并未得出任何可取的特定培养基附加物。Loescher与Mock(1974)发现MS盐类+硫胺素+175mM蔗糖+1%琼脂，能以满足少到0．1mm长胚培养的要求。加复杂附加物如椰乳，酵母提取液，和水解酪蛋白无益。培养很小(0．2mm)大麦胚的Norstog(1973)“大麦培养基11”，也能支持玉米未成熟胚生长。上述二种培养基可作好的起点。
(2)颖果 这种技术能用于任何基因型，适用于人工授粉研究(见A2培养下授粉与胚珠直接授粉)植株营养转运，和种子发育期间灌浆生理学研究。
①采收授粉后2-7天的带谷皮穗。
②用手或用镊子仔细除去全部谷皮与花丝，在超净工作台进行。
③用20%商品漂白粉表面消毒穗20min，无菌蒸馏水淋洗3次，移置培养皿。
④用刀在穗上的成双行颖果间横切，切断穗轴。
⑤把每段切成楔形块，带有4-10个颖果(2×2到2×5)(图17-2)。
⑥接种2-3块于50m1无荷尔蒙培养基上，穗轴向下，装在125m1欧氏三角瓶或直径9cm培养皿中。
⑦25℃暗培。
这种基础培养不是关键性的，可看Gengenback(1977)。
(3)侧芽 玉米按分蘖特性分：如马齿种玉米常不产生分蘖或只有1或2基部分蘖，还有高分蘖品系，并在分蘖上产生顶端雌花序。采用分蘖芽繁殖，可能增高单倍体繁殖率。Fowler与Peterson(1978)发现玉米分蘖，在遗传上与主茎的不同，这种分蘖特性是可遗传的。玉米侧芽的有性传递本身是有价值现象。
①把20天幼苗基部切断，洗、用6%(w／v)次氯酸钠表面消毒15分钟，无菌水淋洗。
②除最幼叶原基外，剥除全部叶片，产生带有5-6侧芽原基的短茎(10-20mm)。
③将这种茎外植体培养在MS盐类，White(1943)的维生素，肌醇555mM，庶糖87．6mM，水合硫酸腺素784μM，同基数的磷酸钠1．42mM，KIN13．9μM，IAA5．7μM，或IBA5．4uM和琼脂8g／L，pH5．6。约10天。
④取长出的侧芽，放在坐根培养基(基础培养基相同，不加硫酸腺素，磷酸钠，IAA和KIN，加NAA 27．0μM)。
⑤约15天后移栽土中。大多数芽将生根和成活。有些最低的芽长成的植株，长雄穗，其上有更多雌小花。最高芽只长顶端雌花序。
(4)花药培养 从1975年中国首次取得玉米花粉植株后，其应用于单倍体生产的主要障碍之一是产生频率低。最近有所改进，应能刺激更多研究，尤其是导致一些基因型发生高反应的生物学因素。
①选择具有适当发育时期的幼雄穗的健旺植株，在其基部割断，移至实验室。
②除去包着雄穗的叶，切取雄穗。
③取主穗顶部和底部和支穗上的少数小花，供检查花粉发育期用。
④在醋酸洋红溶液中涂沫花药确定花粉发育期。单核期花粉产生最好结果。沿雄穗标记花粉发育梯级。
⑤在无菌玻璃量筒内，用20%次氯酸钠表面消毒雄穗约5min，无菌水淋洗3次。放在无菌大培养皿内。
⑥取一束雄穗，放入无菌培养皿。
⑦取各个小花，用开镊子轻压护颖基部，使之张开。
⑧接种在直径6cm培养皿装有10ml培养基上，25℃，暗培。
(5)根培养 组织化根培养物能用于研究植株营养要求(Street，1957)。禾谷类根难于培养，下述一个成功的培养方法：
①将玉米种子(每20m1消毒液放约10粒种子)放在精洁螺旋帽容器中，加氯化汞溶液(0．01%w／v加几滴清洁剂)表面消毒。强烈振动20min。用真空装置(见未成熟胚节)除去消毒液。无菌水洗3次。
②加少量无菌水，放在开口容器中，轻度振荡过夜。除去水，重复消毒程序。有些种子不需要过夜培养和第二次消毒。
③无菌培养皿内加二层无菌滤纸和无菌蒸馏水，把种子沿边排列其上。种子胚向上，种子根向中央。
④30℃暗培开口皿2-3天。
⑤切取根顶端约长10mm。将长约20mm的根，移置无菌培养皿，放在毫米格纸上，可大量切取。避免损伤根尖1-2mm处。
⑥将根尖成对移置20mlWhite生根培养基，含有0．12M葡萄糖和CH，装在100m1欧氏三角瓶中。用棉塞或无菌铝箔封瓶口，在窝动振荡器上约110rpm振荡，25-30℃，光强约20001x。
⑦每隔2-3周，调换“根尖”和“伸长部”，增加培养体的繁殖。
⑧禾谷类根一般难培养。少数几次转移后，培养体干瘪或停止生长。不同基因型间有相当差异。
(三)展望
植物细胞培养的吸引力，常是推理很少实现，这是用单个、独立全能性细胞群体为材料进行研究。直到1980年，禾谷类培养远未能达到人们幻想的理想。从植株直接分离全能性原生质体虽未有值得注意的改进，已见全能性培养体的可喜迹象，可能降低到单细胞水平。这将能立即开展许多玉米遗传操作讨论可能性，尤其如果是原生质体培养。目前已有技术，例如只适用于分离除虫剂或病原菌／毒素抗性，或氨基酸超量抗性突变体。再生植株出现的变异性，也可能有用的。花药培养对植物育种有更为直接的应用技术，远缘杂交后胚拯救也如此。
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