大麦
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第374页（12516字）
大麦是自交可育二倍体(2n=14)种(Hordeum vulgare)，从野生种H．spontaneum驯化而来，其杂种完全可育。目前主要产区分布于中纬度22-63°N，并向干旱和较冷地区扩展。除墨西哥，南美洲西北部、东非的高原地区外，其它热带地区无之。1984年统计，全球种植面积77．4×106ha，总产额171×106t。
(一)研究进展
大麦组织培养历史，主要是研究合子胚生长和发育。最近十年发展了体细胞和配子组织培养方法。
1．合子胚培养 Brown与Morris(1890)首创大麦组织培养，深入测验了离体成熟胚的反应。首次试验用熟石膏或未上釉陶器部分浸入营养溶液，以后试验发现生长在玻璃棉或明胶固化培养基上的胚有所改进。得出结论氮源以蔗糖(最适浓度3．5-4%，102-117mM)为好。继之用栽培品种Jrish Chevalier研究氮源。Brown(1906)提出完全无菌培养体，基础培养基为硫酸钙(5．8mM)，硫酸镁(1mM)，氯化钾(3．4mM)，二氢磷酸钾(1．8mM)，氯化三铁和蔗糖(146mM)。发现门冬酰胺是最有效氮源，门冬氨酸次之，酪氨酸和苯丙氨酸有抑制作用。
Stingl(1907)发现大麦游离成熟胚生长在小麦胚乳的生长比自身胚乳上较好，得出重要结论：胚的营养不仅限于本种胚乳供给。
Hanlan与Pope(1926)首次研究大麦未成熟合子胚，用cv．Hannchen测验在不同湿度下离体颖果内胚生长。
Merry(1942)首先采用琼脂固化培养基。用cv．Alpha和含Shives溶液加58mM蔗糖培养基。比较了离体未成熟胚与正常成熟胚的生长，发现这些胚的生长，与幼苗生长极相似(即它们进行过早发芽)。提出了很小胚(授粉后7-8天)不能生长由于氧浓度过高(与胚珠内的相比)。大麦成熟胚用于同期生理研究，以探讨胚生长期间呼吸特性。
Kent与Brink(1947)试图克服Chevron品种授粉后10-15天胚过早发芽。采用Rando1ph与Cox盐类培养基加58mM蔗糖，发现5g／1水解酪蛋白高度有效。它抑制发芽，但促进正常增大，使胚最后大小比正常成胚为大。Ziebur等(1950)的重要发现，在于溶液中水解酪蛋白的效应，主要是氯化钠和氨基酸产生的高渗透压，由此得出用365mM蔗糖培养基培养幼小(开花后7-9天)长0．3-1．1mm胚成功。具有胚乳的胚生长最好。基于每个胚乳的活性，发现老胚乳最活跃，大麦胚乳刺激Raphanus和Capsella胚的生长。这些条件性效应观察结果，在大麦组织培养历史中反复出现。
大麦胚继后试验可分为二类：(1)成熟胚用于生理和生化研究，常与氨基酸代谢、碳水化合物代谢或休眠分析相关联，和(2)为改进未成熟胚生长的培养研究。后者试图拯救杂种胚珠，虽基本上未得成功。
经20多年努力，Norstog规定了必要条件和改良培养基。他初期研究(1956)用0．15-0．20mm胚，White培养基加90%CW可改进生长。1961年培养60μ-1．5mm胚，发现20%CW加谷酰胺效果更好。并首次提出方位对胚发育的重要性。如果将胚原轴接触琼脂培养基，出现根或芽发育。以后(1963)改用谷酰胺加腺嘌呤，White盐类(263mM蔗糖)，增高磷酸盐含量(44mM NaH2PO4·H2O)，pH4．9。1965用这种培养基培养0．4mm胚，10天后生长到平均3．5mm。小于0．1mm胚产生原球茎状结构，有若干芽和根，首次诱导未成熟大麦胚的增殖之例。
Nostog(1967)提出一系列重要培养基类别，包括新鲜和“老化”培养基，高压消毒和过滤消毒，光与蔗糖含量的互作，在200mM蔗糖上胚发芽的抑制，需要光，比263mM蔗糖上的为多。Norstog与Klein(1972)发现降低氧和较高温度也能抑制过早发芽。还发现室内(16h27℃，8h5℃)或大田(7月)生长的供体植株，产生非休眠胚，温室(1月)生长产生休眠胚。
Norstog(1966以后)开始测验培养基加生长荷尔蒙的效应，用改进的White培养基用于小胚培养，包括ABA的有利效果。最近(1984)未成熟胚发育研究，用J25-8培养基研究ABA和GA对13和17天胚生长的影响，发现ABA10-7和10-6mM生长最好，无论GA浓度如何。自后，用小胚(0．1-0．2mm)培养在J25-8增加渗透压、降低盐浓度，加ABA(5×10-8mM)，硫酸腺素(2×10-3mM)，PIC(5×10-8mM)，脯氨酸(150mg／l)和谷氨酸(300mg／l)，改进了生长。用Pennisetum americanum胚原细胞悬浮培养体预条件的培养基，也有益于生长。未成熟胚研究首先拯救异种杂种胚，更重要的是分离出用球茎大麦授粉大麦后染色体丢失产生的母性单倍体。
“Bulbosum”技术。Kasha和Kao(1970)首次描述最有效的方式，现已成为许多实验室的诱导大麦单倍体的常规技术。最重要因子是亲本的基因型，H．vulgare母本染色体2和3上主基因影响着丢失过程。其它包括培养环境。培养温度低于15℃，多数是杂种胚，而不是单倍体。23℃下大量是单倍体。为了杂种发育，需保持较低温度下5-9天。在23℃下(1-2天)一旦发生染色体丢失，立刻转移到15℃。
2．体细胞组织的愈伤组织诱导和再生 Thomas等(1979)认为禾谷类未分化愈伤组织再生植株尚无有说服力报告，文献所列例证，不过是已有分生组织的繁殖而已。
(1)叶 Saalbach与Koblitz(1978)取大麦(cvs．Vogelsanger Gold与Trumpf)5-6天龄幼苗第一叶培养在改进MS加2，4-D45．2μM和大麦幼苗的水提取液，发现从其基部产生愈伤组织。根据组织学分析得出结论，愈伤组织来自薄壁细胞叶肉组织。只有一个外植体产生芽。
(2)顶端分生组织 Cheng与Smith(1975)用cv．Himalaya与cv．Mari7日龄幼苗取顶端分生组织，培养在改进MS加一系列荷尔蒙(10μMIAA，15μM2，4-D，1．5μM2ip)以产生愈伤组织，能继代在相同浓度的IAA和2 ip加：2，4-D(5-20μM)，NAA(20-40μM)或CPA(20-40μM)。转移到无荷尔蒙培养基后，从28愈伤组织分化产生17植株，其根是二倍体(2n=14)。Kartel等(1978)用四种基因型得到相同结果。Saalbach等(1977)首次用“bulbosum”技术得到的单倍体分生组织区域产生单倍体愈伤组织培养物。再生了10植株(4二倍体，6单倍体)，全都是细胞学反常。Novak(1980)用相同来源的愈伤组织培养结果也是如此。Kasha等(1982)讨论了单倍体细胞培养物的遗传稳定性问题。
(3)成熟胚 Baylass等(1979)测验45品种成熟合子胚愈伤组织形成的影响因子。发现基因型对2，4-D反应显着不同，供体生长条件也不同。加KIN对愈伤组织形成无反应或抑制。未测验其再生。
Vostrakova-Nemcova等(1982)培养品种Koral成熟胚以盾片接触R8培养基。从培养在13．6μM2，4-D培养基上的1200胚中，79%产生愈伤组织，经转入再生培养基(IAA2．9μM，KIN或BA4．4-8．8μM)，只见生根。取200根尖观察是二倍体，4个除外。
离体成熟胚也用于检测烷基试剂MMS的影响。6mM处理3h，25℃，产生高频率染色体畸变，和抑制根尖有丝分裂活动。
(4)未成熟胚 Dale等(1979)报道未成熟合子胚形成愈伤组织和再生植株。最近Sharma等(1984)用var．Golden Promise 10-14日龄胚，在24℃，12h光周期下，培养在J25-8，加9μM2，4-D，完整胚或切取部分得到增殖和盾片组织的分化。如果再加3．2μM BA，增殖和愈伤组织形成受阻，增加了芽分生组织启动。Withers(1982)也用未成熟胚进行深冻保存研究。
(5)种子根 Scheunert等(1977)用B5加9μM2，4-D，把cv．Bulgarische Nackte和Elgina种子根培养在25℃，愈伤组织继代四年。Landova等(1979)观察大麦胚的根有丝分裂，培养3天后，有丝分裂指数逐有下降。继续培养未获成功。Sekiya等(1977)用培养发芽种子比较生长素类型对根愈伤组织的产生，发现1mM IBA比IAA，IPA或IVA更好，10μM2，4-D产生同样反应。
(6)茎切段 Ruiz等(1982)用减数分裂时的茎节进行细胞学研究，培养在LS加9μM2，4-D，细胞学观察指出培养开始只见二倍体有丝分裂，5月龄愈伤组织出现四倍体细胞，缓慢地增多。36月后，群体中50%细胞是二倍体，50%是四倍体。组织学观察指出表皮和皮层薄壁细胞产生愈伤组织。直到5月龄髓薄壁细胞未包括在内，提出它可能是四倍体愈伤组织细胞之源。
(7)子房 Orton(1979)比较一系列外植体：子房、花药、茎、叶切片、芽和根分生组织后，发现根分生组织、未成熟子房和果柄，3日龄胚和胚乳产生愈伤组织。用内颖与成熟内颖之比为0．1-0．5时子房培养时，产生愈伤组织的最适培养基是B5加2，4-D(18．1-22．6μM)和蔗糖(88-117mM)。并用18．1μM2，4-D和88mM蔗糖作愈伤组织保持培养基，芽、根再生用1．4μM KIN，2．9μM GA，29mM蔗糖和55mM葡萄糖。芒麦草和大麦×芒麦草(2n=3x=21)长期愈伤组织培养取得芽再生，但培养大麦未能再生。Orton(1980)进行了详细细胞学研究。
(8)胚乳 未成熟胚乳在含4．52μM2，4-D培养基上，诱导产生愈伤组织(San等，1981)。转移到低生长素上，分化产生许多植株，其中有白化苗。根尖染色体7-28。
(9)外植体类型比较Dale等(1979)用cv．Akka和Himalaya分生组织尖、叶鞘、中胚轴、根尖(10mm)，未成熟和成熟胚为外植体，后三者产生愈伤组织最多，未成熟胚(0．3-1．4mm)产生颗粒状愈伤组织最多。培养基比较以B5加4．53μM2，4-D最好。根虽能从不同愈伤组织类型再生，只从未成熟胚愈伤组织生芽。在移入无2，4-D再生培养基前，以4．52-13．56μM2，4-D处理28天最为相宜。
(10)再生植株遗传稳定性 Deambrogio等(1980)测验培养在4．52，9．0，13．56或18．1uM2，4-D28天未成熟胚再生植株的子代。每种2，4-D浓度取18株，各取种子3粒观察结果，只有18．1μM2，4-D下再生植株有变异。有更多不育分蘖，一株有叶／白化叶。Dunwell等(未发表)观察cv．Golden Promise未成熟胚再生株和“bulbosum”技术产生的未成熟单倍体胚子代的农艺特性，与种子产生对照植株相比较，只有未成熟合子胚出现明显变异，包括芒出现日期、株高和单株产量。
(11)原生质体 Kao等(1974)首次报道大麦原生质体分离和融合，设计了叶分离原生质体和各种异属融合方法。未见愈伤组织产生。继后取得叶和根愈伤组织原生质体的细胞簇，未见器官分化。最近原生质体研究，把大麦再生植株在无菌条件下生长，以保证叶无污染。经Onozuka R10纤维素酶(2%)，Macerozyme R-10(0．3%)在24℃暗培4h，非商品酶SP129(Novo工业公司A／S丹麦)更有效，处理45min内释放原生质体。
原生质体曾用于研究转化、膜潜势、电融合、深冷保存。广泛用于研究病毒吸收和真菌毒素。Vasil(1983)评述了禾谷类原生质体分离和培养。
3．配子组织诱导愈伤组织和再生
(1)诱导单倍体 Johanson(1934)最先描述大麦单倍体以来，已有许多方法分离大量单倍体。一次法产生同质系，单倍体诱导为植物育种和遗传研究所乐于采用。
(2)子房培养 San Noeum(1976，1979)首次从培养大麦子房产生单倍体，频率低2-6／1000子房。都是绿色单倍体。Wang等(1981)证实之。Huang等(1982)报道单倍体胚源自卵器，偶有从反足细胞产生的。Jensen(1981)指出开花后3天子房最好。培养基渗透压从500降到115m Osm有益。
(3)花药培养 Clapha．m(197l，1973)应用曼陀罗花药培养技术于大麦。Sunderland等(1981)有所改进。需要控制的培养因素：①材料基因型，②供体生长条件，③取样时花粉发育时期，④离体小穗，花或花药的予处理，⑤单位体积培养基接种花药数，或用条件的培养基。植株的可靠分化技术尚不清楚，大都是白化苗，由于叶绿体缺失所造成。Friedt等(1981，1983)从小孢子产生了大量加倍单倍体，集中于以F1为供体的研究，从自交大麦再生的加倍单倍体子代遗传变异类型，还不清楚。但已取得育种上有价值的大麦黑嵌合病毒抗性(Foroughi-Wehr等，1984)。更重要是这是从禾谷类单细胞再生植株的仅有可靠方法。单倍体愈伤组织曾用分离突变体研究，如粉霉毒系侵染，以测验寄主-病原菌关系。发现分生胞子可在愈伤组织上发芽，但无菌丝或克隆。侵染再生单倍体指出寄主细胞光合活性对粉霉发育无关重要。Dunwell(1985)评述了禾谷类胚珠和花药培养。
4．突变体分离 最全面地整胚研究是分离出氨基酸生物合成变异体。同法分离除莠剂Asalam抗性的胚。Ho等(1980)研究半籽检测以取得荷尔蒙感性改变突变体，Henke(1981)选择对S-2-氨基乙烯-L-半胱氨酸和放线菌酮非敏感性。Orton(1980)用愈伤组织培养体比较完整植株与组织培养体的耐盐性。但未有抗性系报道。用一系列组织的愈伤组织研究病原菌抗性突变体。Branchard(1982)用毒素“rhychosporoside”(真菌Rhynchosporiorium产生的1，2-propanediol的纤维二糖苷)处理中胚轴愈伤组织，显见无影响。Wenzel等(1984)用几种Fusarium种产生的非专化枯萎毒素萎蔫酸(0．2mM)处理小孢子愈伤组织，分离出无疑的抗性愈伤组织。
(二)培养方法
1．“Bulbosum”技术取最适条件(16h18℃；8h12℃)生长的大麦植株作产生单倍体的供体，去雄，取已春化(10℃或以下，8-10h光周期，8周)的二倍体H．bulbosum选系花粉授粉，用棕色纸袋套已授粉穗，保证最大结实率，大多数学者推荐用GA 217μM加吞温20(0．25%)，授粉后3天内每天喷或只喷1次。授粉后约14天，取发育中颖果，消毒，取未成熟胚(不带胚乳和母体组织)，用液体培养基洗，接种于固化培养基，暗培，20℃。J52-8成分适用于整个发育时期的胚，暗培14天后，转入光(12-15h)，大部分培养的胚发育成再生植株，鉴别偶见杂株，根叶鞘有柔毛除去之，其余单倍体用秋水仙素加倍染色体数。取约5叶健株半浸入秋水仙素溶液(2．5mM溶于2%DMSO)5h，光，20℃。再生植株移入堆肥，生长成熟。
在理论条件下，适宜基因型，每人每周用这种技术估计可产生300单倍体。这项技术的效果，可用下列事实证明，Ciba-Geigy种子公司1974开始单倍体培养计划，五年内推广加倍单倍体cv．Mingo。第二个cv．Rodeo现已注册，cv．Gwylan将在新西兰市场出售。
2．花药培养 上述花药培养反应，有赖于基因型和供体植株生长条件。高光强(18000，200001x)生长植株小孢子愈伤组织频率比低光强(8000，100001x)的为高。12℃日／8℃夜比较高温度下生长要好。
应选取单核中期花粉的花药。约在剑叶抽出后最初2天，露穗长25-100mm。用90%乙醇擦后，从叶鞘中取出穗。立即从小穗取出花药，接种在培养基上。取花药前将穗预处理效果较好。将穗放在封闭培养皿中，加几滴水保持高湿度，产量最高。注意水不与穗直接接触。推存温度和预处理时间为4℃28天或7℃14天。
花药25℃暗培，N6液体培养基，或马铃薯培养基加2，4-D 6．8μM，KIN 2．3μM，肌醇5．5mM产量最高。Foroughi-Wehr等推荐用固化培养基MS，加IAA 5．7μM，BA 4．4μM。接种密度也很重要。预处理花药至少每毫升60个。同条件的培养基可克服这种要求。条件化以用新切取小穗的大麦子房是最有效的外植体。每毫升培养基用4个子房，处理7天。Wenzel等(1984)曾用此法分离萎蔫酸抗性小孢子愈伤组织。
小孢子愈伤组织约1mm时，转入固化再生培养基，蔗糖2或3%，IAA 2．3μM，BA 1．8μM，或IAA5．7μM，BA8．9μM。18℃下，转移的愈伤组织半数再生植株。但大都是白化株。
促进绿色再生株生根。转入MS加活性碳5g／l。大都再生株是二倍体(2n=14)，由于培养早期染色体自发加倍。常设想它们是完全同质的，实则并不一定如此。
(三)展望
花药培养和%ulbosom”技术应用于大麦组织培养与其它作物效果差异极大。花药培养已诱导43属中120种产生单倍体，尤其是茄科，十字花科和禾本科。许多国家进行研究和应用，中国已育成许多小孢子品种，包括烟草、小麦和水稻。Dunwell(1985)详细评论了花药培养技术。
与之相反，“bulbosum”技术局限性很大。用球茎大麦给小麦授粉后产生高频率单倍体，但只有有限基因型。这种遗传局限性似与小麦-黑麦不亲本体系相关连。其它禾谷类种没有与bulbosum授粉能诱导产生单倍体的。但禾本科中其它异种组合确有染色体丢失的可能，由于胚早期退化未能予以鉴别。
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