马铃薯
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第389页（21225字）
马铃薯(Solanum tuberosum L．)属茄科、茄属植物。是世界上重要作物之一，其生产仅次于小麦、水稻、玉米和大麦，居世界第五位。
马铃薯的细胞组织培养技术比较成熟，在脱毒繁殖应用上已取得巨大的经济效益。
(一)研究进展
1．愈伤组织和细胞悬浮培养物 马铃薯愈伤组织培养首次成功于1951年(Steward与Caplin，1951)。块茎薄壁细胞培养在基础培养基加2，4-D和CW，以诱导和增殖；5周内，活跃生长中的愈伤组织比外植体大50倍。Chaplin(1955)取得同样结果，以后许多学者从许多不同外植体如叶、叶柄、子房、花药、茎、根和茎尖产生了愈伤组织培养体。1975年Lam报道从马铃薯块茎愈伤组织培养在MS盐类，Nitsch等(1979)有机成分、蔗糖，CH、AA、GA、KIN和BA诱导胚状体和芽。BA对从体细体胚诱导芽有重要性。但这类芽反常，Lam(1977)进行改进取得了正常再生植株。主要是改变了生长调节剂：IAA和KIN浓度增高，加入NAA和ZEA．Roest等(1976)切取复叶穗轴培养在改进的MS+BA，IAA，GA形成的愈伤组织再生了芽．芽发育和伸长需加GA；否则只在愈伤组织表面形成瘤状结构，通常不再继续发育。切取在含GA培养基产生的芽，培养在含低IAAMS培养基上生根。GA的作用，在于促进芽分生组织的芽发育。Jarret等(1981)报道GA抑制马铃薯块茎启动芽分生组织，但为芽生长和发育所必需。其它植物种研究结果也如此。茎尖培养在MS+2，4-D，NAA，KIN或单用NAA产生的愈伤组织可产生复芽。再加BA和GA，则每块茎尖愈伤组织可使芽数强烈增多。Jacobsen(1977)从双单倍体马铃薯无性系的叶愈伤组织取得再生植株成功。
一般用松散愈伤组织培养物易于产生悬浮培养物。所用培养基含有生长素(2，4-D)和少量或不加细胞分裂素。Edward马铃薯悬浮培养物经2天滞后期，继而进入指数生长期，约2．5周结束。启动接种量超过鲜重16mg／ml培养基时，生长曲线与之相对独立无关。单个离体悬浮细胞及其产生的原生质体可再生植株，但再生频率和再生植株倍数性至少部分依赖于细胞培养的长度。品种Superior愈伤组织系建成悬浮物前，保持12个月，其单细胞再生频率只有10%。双单倍体马铃薯叶愈伤组织培养物培养4-6周后，产生2x、4x和8x细胞，还有非整倍体。多倍体性和非整倍体频率因愈伤组织基因型而不同，八倍体的产生与生长素源有关。这些组织产生了许多多倍体性或非整倍体性再生植株。
愈伤组织培养期间倍数体水平有增高趋向，虽是应用上一个严重缺点，如需保持基因型稳定性，但也有利之处。如人工培养染色体加倍可代替秋水仙素处理。非整倍体和、或其它遗传畸形频率，可用限制愈伤组织培养时期使之降低。利用相对短期培养，从茎尖愈伤组织再生的复芽，其叶、花或块茎形态或染色体数无变异。从愈伤组织培养物再生无病毒植株，可作为传统分生组织培养的另一种消除病毒的方法。
应用愈伤组织培养系统于马铃薯抗病育种成功不多。Ingram等(1965)证实了从抗性品种的组织培养集聚体产生了phytophthora infestans小种4抗性，但来自感病品种的无效。Behnke(1979)选出对P．infestans过滤物的抗性愈伤组织；这种抗病非族专性的，可经再生植株和诱导产生的愈伤组织中保持。采用同样方法从相同双单倍体马铃薯克隆的愈伤组织筛选对Fusarium oxysporum的培养体过滤物的抗性，取得成功但非免疫性的。再生植株的反应未见报道。由此可知，有可能从离体培养选择愈伤组织，继而产生对真菌病原菌的大量抗性植株。但尚待改进。
2．消除病原菌 植物材料在离体培养前必需表面消毒，否则真菌和细菌以其生长优势，很快会超过植物材料的生长，和杀死植物。特定情况下可用抗生素控制细菌和真菌的生长。病毒最难消除，是马铃薯组织培养的主要问题。简言之，如果不把病毒消除，则任何快速无性繁殖体系，病原菌也会很快增殖。常用热或化学处理，继之切取分生组织培养以消除病毒(图18-1)。染病植株放在36℃16h和30℃8h热处理4周，连续光照。热处理原理是抑制病毒繁殖，而分生组织仍能生长。
图18-1取得经病原菌测验后的植物材料图解
用解剖法取得分生组织，接种在适当培养基上，经几周而再生植株。然后把这些植株在离体培养下加快繁殖，取得定量材料供病毒测验用。应取长势旺壮的植株作为供试材料，鉴定无病状态(植物卫生)。测验植株营养部分，并根据接菌指标寄主病征选取病毒负反应材料，如A，M，S，T，X，Y，卷叶病，安第斯马铃薯潜伏病，安第斯花斑病，番茄黑环病和马铃薯环斑病，用乳胶或ELISA血清学和电镜检测。用核酸斑杂交测验(NASH)，马铃薯纹线形块茎类病毒是负反应。
这种经病原菌测验的(即无病原菌的)材料用作核心母系，从中产生鉴定的种子块茎。
Cassells等(1982)用0．1-0．15mm分生组织顶尖培养在含205μM Virazole(合成ribavirin)培养基上，消除了若干马铃薯无性系X、Y、M。Klein等(1982)用Russet Burbank和Red McClure的方法取得相同结果。但用低Virazole和植毒素，即在41μM时，芽发育推迟2个月，410μM时杀死二者的分生组织。S，X和马铃薯块茎类病毒是最难消除的。Smith等(1968)用33-37℃处理X，S侵染植株6-8周，然后取分生组织顶尖培养，取得了无病毒植株。Mac Donald(1973)培养热处理的萌芽的分生组织顶尖，产生了少数无X和S病毒植株。Lozoya-Saldana等(1982)在切取分生组织和芽再生前，用寄主生长的超适和适温相间处理，取得5个无病毒克隆。耐热性，病毒钝化和芽发育，视栽培品种而异。与其他学者研究结果相符。
3．离体培养微繁殖 虽已能从单细胞或愈伤组织培养再生植株繁殖大量马铃薯植株，这些方法尚未正常采用，由于它们能影响植株材料的克隆稳定性。为此，微繁殖标准方法，有赖于解除腋芽的休眠。
(1)单节插枝 从块茎上取下的无病原菌再生植株上，切成单节插枝。每节带有一片小叶和一个腋芽。小心切下小叶，其余接种在MS繁殖培养基上。培养2周后形成植株，6-8周后离体培养再生植株可供继代用。这种程序可反复进行，直到取得所需苗数。以此繁殖率推算，每年可产生几百万株。
振荡液体培养物切取离体培养植株的茎，横放在装有液体繁殖培养基的瓶中2-3周后，沿着茎全长上的腋芽将能长出，这些再生植株可供继代用。
(2)产生单主根的再生植株 采用上述二法产生大量材料供单节插枝培养，培养在无菌塑料箱内，每箱25枝。3-4周后，这些节生长和生根，可供移植中。这些再生植株可用为常规繁殖的母株，或转移到苗床或大田，以产生鉴定基础种子块茎。
4．种质保存 近10年来，植物遗传资源保存日益重视，尤其是遗传基础正在消蚀的重要经济作物。许多年来收集了大量马铃薯种质，国际马铃薯中心现已收集到约6000份。其中有许多是不育克隆；其余高度异质的，意指这种材料的种子，与廉本克隆很不相同。目前用大田营养繁殖法保存种质资源，费地费工，还有受自然灾害的高度危险，例如霜、雹和病原菌侵染。这些材料正在转入人工培养储存体系中。方法是把材料移入无菌(虽非无病毒)人工培养。然后把幼茎叶转入储藏培养基，培养在8℃，10001x，16h光照。在这些条件下，培养体生长率显着降低；正常条件下每6-8周要转移一次的培养体，每二年只要转移一次。
深冻保存和最低生长储藏应用于马铃薯取得满意结果。Bajaj(1981)从-196℃贮藏2年然后在35-39℃解冻的分生组织再生植株。用二甲基亚砜(DMSO5%)和甘油(5%)和蔗糖(5%)为深冻保护剂，分生组织存活率最高。腋芽和茎尖分生组织比块茎萌芽的生存率较高。在某些情况下，解冻分生组织基部产生愈伤组织，能诱导产生芽分化。马铃薯和S．goniocalyx的茎尖必取得成功。由此指出分生组织深冻保存对马铃薯种质长期保存有卓越潜势。
最低生长贮藏可应用于广泛茄属种和栽培品种。由于遗传稳定性和保持形态建成潜力，最常用分生组织顶尖培养体这种方法的目的，在于降低储藏培养物生长率，只需论年转移。采用降低培养温度和增高培养基渗透压。也可用低ABA，但会降低某些品种的生存率，视培养基成分而定。用MS+88mM蔗糖不加荷尔蒙，温度6℃(夜)12℃(日)，若干茄属平均生存率为80%。Roca等(1982)用8-10℃下，培养在MS+0．58μMGA+19μM ABA+88mM蔗糖储藏10-12月，马铃薯培养物生存率达92%。
采用上述微繁殖法，从各个生根再生植株培养在小玻璃试管内产生许多小组织培养物的再生植株。把这些试管包装在特种聚苯乙烯箱内，加植检疫标签，然后航空寄递。接到邮件后，可继续人工繁殖，或把再生植株移入钵中。1984年国际马铃薯中心用此法输出了2500株以上。这些方法可从进口的少数培养物很快繁殖无病母系，每2-3周可望增加再生植株5-10倍。
5．器官发生和体细胞无性系变异 马铃薯植株有突出发育可塑性。从游离原生质体，单细胞，愈伤组织培养体和植株任何部分外植体都可能再生完整植株。
从这些组织经形成愈伤组织，继之重新产生芽，再生植株与启动材料的遗传性并非相同。一些学者把用这些方法诱导产生的变异叫体细胞克隆变异，是改进现有马铃薯克隆的有用方法。假说是采用标准微繁殖法，从诱导产生的次要变异，经筛选，选择和克隆那些有特殊特性的植株。若干研究所测验了这些方法，产生了改良品种。
6．花药培养 Sopory等报道了从四倍体马铃薯花药培养产生二倍体(双单倍体)植株的方法。但是，对这种技术的反应有赖于供试克隆；有些易于产生“花粉产生的”再生植株，其它则无此可能。初步论证指出克隆反应性差异可能是受遗传控制的。
花药培养技术相对简易。取表面消毒的芽，选取适宜发育时期的花药，培养在适宜培养基上。培养几天后，能发生反应的克隆，少部分花粉粒改变它们的正常发育途径(发芽和生长花粉管)，代之以开始有丝分裂，这种分裂是高度有组织的，形成花粉胚。这种花粉胚性途径继之产生若干发育时期，后者与种子胚形成的发育状态相同。由此终于长成成熟植株，形成马铃薯育种者为有用资源。
栽培马铃薯与其它茄科种不同，对花药培养反应差。从四倍体cvs．和双单倍体克隆产生的单元单倍体曾产生双单倍体再生植株，但频率极低。Irikura(1975)用17马铃薯和3种杂种花药培养的花药胚再生植株。包括结薯和不结薯种，但不是栽培种。
栽培种花药培养虽有困难，但有所进展。其关键重要因子是：培养基组分，小孢子发育时期，和供试植物基因型。Sopory(1979)报道MS加0．18M(6%)蔗糖、0．5%活性炭，6μM IAA和4．0μM BA，结果一个选择的双单倍体克隆有40%花药产生胚。只有胚胎发生启动时期需要高蔗糖；在高蔗糖培养基中培养6-8天后，转入MS+0．06M蔗糖，这些花药的胚胎发生并无抑制现象。BA效应不能为其它细胞分裂素所代替，IAA是最有效生长素。但是，Wenzel等(1981)报道在花药培养基中完全不加生长素。活性炭的有益效应，可能是吸收培养基中的或花药壁释放的抑制物质。
小孢子发育对胚发育有显着影响。四分子或双核小孢子的胚胎发生频率很低(<4%)。最适时期一般是单核期或单核后期。
供试植物基因型对马铃薯花药培养成功影响最大。某些基因型的“反应性”是遗传特性，但其遗传方式尚未肯定。有些基因型由于在单元单倍体或同质状态的二倍体中存在致死基因，不能产生存活胚，但异质双单倍体供试植株则无此影响。此外，Wenzel等(1981)提出基因型间的差异，可能部分由于对培养基成分敏感性不同的结果，尤其是生长调节剂。用反应好的与差的基因型杂交，每种杂交F1不同，但报道的二种杂交，能以分离出若干反应好的入些克隆。这些结果指出，培育花药培养“再生能力”是可能的，可能是离体培养马铃薯改进规划的重要部分。
当用双单倍体克隆作供体，可望产生单元单倍体，但也取得了双单倍体，多倍体和非整倍体。这是马铃薯花药培养的主要困难。不经中间愈伤组织阶段直接诱导花粉胚，雄核发育，应能降低多倍体和非整倍体。但是胚发育期间倍数性水平可能增高，可能是染色体加倍和针对单元单倍体胚的负选择的结果。早期从胞子体组织产生双单倍体与加倍单元单倍体可能无差别，由此，曾利用控制二个互补基因的显性标记基因“胚斑”，以识别再生植株的来源。培养离体花粉代替完整花药，是另一鉴别方法。此法曾用于双单倍体无性系和四倍体cv，但只限于胚形成。
7．离体培养生产块茎 马铃薯常规繁殖法是种植块茎。最近技术可用离体培养生产块茎。其优点是小、轻、和无菌的，但其在田间生长植株完好正常。离体培养块茎，可用作输出马铃薯种质的崭新方法，可能成为商品种子块茎。
离体培养块茎诱导的启动材料，是若干三角瓶的微繁殖用的振荡液体培养物，仔细地除去液体培养基，代之以块茎诱导培养基，加有500ppm CCC(氯化胆碱)。一经处理，只要5周，即可长成表型成熟块茎，供收获。国际马铃薯中心培养了50以上基因型，全都反应良好。
离体培养产生的块茎，其色泽和形状特征与大田块茎相似，块茎储藏蛋白质电泳谱相同。可望不久可成为马铃薯种薯生产的新途径。
8．原生质体培养 栽培马铃薯许多四倍体cvs．和双单倍体选系和野生种千年不烂心S．phure．ja，龙葵和S．phureja×S．chacoense的原生质体分离、培养和再生植株取得成功。十年前首次从马铃薯块茎分离取得原生质体，但不分裂以形成存活愈伤组织。1975年Upadhya在规定培养条件下，从温室栽种的Seig1ande马铃薯叶的原生质体分裂，产生了存活愈伤组织，有些生了根。但未见芽的形成。Shepard与Totten(1977)首次报道从四倍体RussetBurbank马铃薯原生质体再生植株。次年，Binding等(1978)用四个双单倍体选系芽培养物分离的原生质体再生植株。其中之一从悬浮培养体分离的原生质体再生植株成功。Butenko等(1978)从人工培养的马铃薯叶肉原生质体取得植株再生，但其形态和染色体数反常。
原生质体培养必须具备许多因素尤其是：a．供体植株生长条件和状态；b．原生质体分离溶液和培养基成分，和c．培养环境，即温和光。
(1)供体植株 大田生长马铃薯植株不适用于原生质体分离。温室生长的较好，但不可靠，视气候和采用的分离原生质体方法而定。为了取得相当程度可重现性，常需栽种供体植株于严格控制环境和营养条件。Shepard等(1977，1980，1981)用标准湿度、营养、温、光和相对湿度的人工气候生长室栽培块茎产生的马铃薯植株，发现这些严格条件是原生质体分离和培养成功所必需。其他学者用芽培养物或离体培养生长植株为给源，以克服大田和温室生长植株的变异性问题。
(2)原生质体分离溶液和培养基 学者们采用原生质体分离溶液和培养基各有不同。Macerozyme用于分离马铃薯叶和双单倍体无性系，S．dulcamara和龙葵。Grun等(1978)发现了它对S．phureja×S．chacoense杂种叶分离存活原生质体不利。Schumann等(1980)报道各种组合的酶均可用于S．phureja细胞悬浮体。
同样，原生质体分离培养基的渗透剂成分也有不同(表18-1)，虽然有机成分(例如甘露糖醇、山梨醇、蔗糖)是优于无机成分(例如CaCl2)。酶处理环境条件为温度25-30℃，光照从暗到5000lx白炽光。此外，处理时间视酶浓度而有异。
表18-1 Solanum种分离原生质体用的原生质体源、酶和渗透剂成分
自分离原生质体到再生植株循环程序可相对简单到相当复杂。Shepard(1982)采用5种培养基，用了各种类型和用量的大和微量矿质元素，有机成分，渗透剂成分和生长调节剂。Binding等(1978)提出双单倍体无性系使用3种培养基培养和再生植株。培养基是改进的Kao与Michayluk(1975)，培养基8P，用MS或BS诱导芽形态建成，加适当生长调节剂。
(3)培养环境 一般采用低光强，例如4001x连续白色荧光，直至形成细胞簇或小愈伤组织。但是Shepard等(1977)报道较高光强至少40001x，是马铃薯愈伤组织变绿和继之芽形态发生所需。16小时光周期与连续光照同等有效，只要光强足够高。芽一经形成，并在生根培养基上伸长，光强降低到2001x可促进根发育。生长和发育最适温度为24℃，28℃以上一般不利。
(4)体细胞杂交 Wenzel等(1979，1982)设想了马铃薯“分析合成育种方案”，其中包括原生质体融合。马铃薯(4x)×S．phureja(4x)孤性生殖产生双单倍体马铃薯无性系，其中选择有价值特性的，经小孢子培养产生单倍体，继之白发染色体加倍。结果产生的同质双单倍体与其它双单倍体杂交，产生有价值特性的F1杂种。最后，用选出的诸杂种经原生质体融合产生四倍体克隆，具有质和量遗传特性的最适组合。
由于缺乏可供选择的标志，马铃薯体细胞杂交进展受阻。从二种双单倍体克隆分离的原生质体融合再生的2000株中，未见体细胞杂种(Wenzel，1982)。采用互补突变(如叶绿素缺失)或不同显性表型标志中的二个系融合，或机械地分离融合产物，可能克服这些困难。
Butenko等(1979，1980)用马铃薯(cv．priekulsky rannii，2n=4x=48)愈伤组织分离的原生质体与S．chacoense(2n=2x=24)叶肉原生质体融合。选择在培养中：S．chacoense不能持续细胞分裂或马铃薯的不能再生芽，培养其融合产物。取得3株再生植株，其中二株缺乏叶绿素不能生存。第三株生根和营养繁殖成功。观察到许多形态特性是双亲中间性，如叶形、块茎包和形，分析RuBPCase亚单位证实了这种无性系的杂种性质。这种酶的小亚单位(核编码的)含有与马铃薯和S．chacoense核基因表达相当。此外，分析其细胞器DNA指出了线粒体来自S．chacoense，叶绿体来自马铃薯。杂种染色体数为60(期望数72)，可能是a．杂种染色体丢失，或b．．S．chacoense叶肉原生质体(2n=24)与马铃薯非整倍体愈伤组织原生质体(含有染色体36不是48)融合的结果。
最近，Binding等(1982)用马铃薯双单倍体无性系芽培养体分离的原生质体与龙葵抗atriazine无性系的融合，从2000以上原生质体融合中再生了芽，基于形态选择，鉴别了11个体细胞杂种。
马铃薯原生质体也能与其茄科属的相融合。Melchers等(1978)报道马铃薯双单倍体无性系愈伤组织原生质体与Lycopersicon esculentum Mill var．cerasiforme(Danal)Alef，突变体黄绿6(Rick)的叶肉原生质体融合，分离出4体细胞杂种，并用RuBPCase分析予以证实。继后试验中，取得了更多体细胞杂种，总计12株。限制性核酸内切酶分析这些克隆的质体DNA，证实了8株只含马铃薯质体DNA(ptDNA)，和4株含番茄ptDNA。全部杂种不育，不可能进行遗传分析。马铃薯双单倍体叶肉原生质体曾与烟草的愈伤组织原生质体融合。酯酶和淀粉酶同工酶分析证实了取得的植株是体细胞杂种，但只产生了不正常茎叶。
马铃薯人工培养再生植株常见形态变异。Van Harten等(1981)，观察到马铃薯叶柄、穗轴和叶愈伤组织再生株中各有突变频率50．3%和12．3%，并未加任何诱变处理。Ha等(1983)用分生组织顶尖或茎尖培养产生的植株常现亲本原型。Denton等(1977)从茎尖培养物取得形态变异的再生株。并未测出块茎蛋白质电泳谱带型的差别，提出形态差异是环境因素所造成。Shepard等(1980)，Ayers等(1981)，Thomas等(1982)用商品品种原生质体再生植株中，观察到许多园艺特性和抗病变异。Russet Burbank马铃薯原生质体产生的65个无性系，至少有一种特性与亲本的不同。包括：a．生长习性，有些方法产生无限生长型弱的蔓，树冠较紧凑；b．成熟期，3个较早，4个成熟较迟；c．块茎特性，许多无性系的大小，形状，皮色和光滑性，总块茎数与亲本不同，但块茎重并不比亲本的重；d．开花对光的要求，有些在13小时光周期下开花，亲本要求16h。原生克隆对二种病原菌敏感度不同，早疫病菌Alternaria solani，和晚疫病菌Phytophthora infestans(Matem等1978；Shepard等1980)。用A．solani培养物过滤物处理R500个Russet Burbank马铃薯无性系，有5个敏感性较低。当用的病原菌接种时，4／5表现抗性增高。另一试验，Shepard(1980)用P．infestansO族接种800个无性系，有2．5%产生抗性。抗性反应表现在叶上分散坏死病斑到低水平耐性。有些抗性原生克隆，经接种P．infestans1，2，3，4族后，感染度比亲本为轻。抗性遗传类似次要基因或数量抗性，而不是主基因抗性；所有情况下，感染叶上病灶内产生芽孢。无性系间的A．solani和P．infestans抗性间无相关。
Thomas等(1982)用四倍体①Maris Bard马铃薯芽培养体原生质体再生株中观察到变异。评价了10种形态性状：叶色、光滑，杂色、花青素色素，小叶形、旺势，和株高。与亲本形态相似的只有1／23无性系；大多数与亲本和相互间有3个或更多性状不同，几乎全都比亲本生长旺势较差。由此可见，至少部分变异是原生质体再生植株过程中愈伤组织阶段产生的。细胞遗传分析，证实了再生株的高频率非整倍体性。除一株外，25株染色体数为46-92个。但是，四倍体Fortyfold马铃薯再生植株有30%是整倍体，染色体数全是48。非整倍体染色体数为46-49。Maris Bard马铃薯的芽或叶小片再生植株全是整倍体(48)。这二种品种间非整倍体频率和程度的差异，可能是培养技术不同所致。由于所用诱导再生技术不同。Maris Bard马铃薯原生质体分离、培养、再生芽采用Thomas(1981)法，而Fordyford马铃薯原生质体再生植株程序与Shepard(1980)法相似。原生质体来源和生长荷尔蒙浓度也有不同。但由于未用同一供试栽培品种，基因型因素仍不能排除。
与上述四倍体马铃薯观察结果相反，双单倍体原生质体再生植株变异很少。其中非整倍体频率很低，只有4%，染色体数有增有减。几乎全是四倍体，由于离体培养中自发加倍产生。但是，当延长愈伤组织培养程序，非整倍性频率有所增高，或用悬浮培养物为原生质体来源，结果相同。四倍体马铃薯栽培品种单显性组合位点，在原生质体培养期间，产生单基因突变，是再生植株变异(表达)的潜在致因。但是，双单倍体原生质体培养体，在染色体加倍前，产生相似突变，由于降低了在再生植株中表达的机会。
(二)培养程序
1．马铃薯茎尖培养 下列程序采用Goodwin等(1980)法，适用于较大茎尖(15-20mm)繁殖，不产生中间愈伤组织期。培养的茎尖上产生的腋芽分生组织增殖。
(1)制备和切取茎尖
①用自来水擦洗块茎，浸入1%次氯酸钠10min。
②把块茎切成2-4块，浸入0．29mM GA1小时。
③培养在用1．0mM CaCl2浸湿的滤纸上。18±2℃，扩散日光。
④当芽伸长到15-25mm时取芽，用切口端插入熔解(55-60℃)石蜡中(以防止吸取消毒溶液)。
⑤把离体茎尖浸入1%次氯酸钠加0．1%吞温20表面消毒7min，轻度振荡。
⑥用无菌蒸馏水淋洗4次。
⑦把芽切成长10-20mm小段。
(2)培养基
①制备MS不加水解酪蛋白或琼脂；加2．3μM KIN，和0．29μM GA(GA溶液过滤消毒，冷却，培养基消毒)。
②取10或20ml MS分别倒入50或100ml欧氏三角瓶。
(3)培养条件
①每瓶接种一片茎尖，加覆盖物，离瓶底1-5mm内。
②将覆盖的瓶培养在18士2℃，绿灯，光强28μEm-2s-1i；3-4天。
③培养体培养在上述相同光、温下，放在回复振荡器上50转／min，每天1．5h。
④振荡培养4周后，移入绿灯47μEm-2s-1，16h光周期，21℃日，16℃夜，最适温度视供试栽培品种而异，静止培养4周。
(4)收获腋芽
①把培养瓶中的含有物移入无菌培养皿。
②切取15-22mm芽用于生根或继代。
③盖好培养皿，按上述培养条件静止培养；每1-2周应产生一次新芽。可收获茎尖3-4次。
(5)继代 重复上述培养基到收获腋芽程序，用新鲜收获的腋芽茎尖，降低GA到0．03μM，增高KIN到23μM。
(6)离体芽生根 取茎尖培养在50ml欧氏三角瓶中，装有5mlMS培养液，加0．57μ．MIAA和29mM蔗糖。21℃日，17℃夜，16h光周期。荧光，48μEm-2s-1，以诱导生根。2-2．5周后，把再生植株移入1∶1混合的蛭石和泥炭中，高湿度，保持2-6周。
另一种方法。把芽插入湿钵混合物中，深10mm。混合物为每36L1∶1真珠岩-泥炭混合物，含有56g血和骨，5．6g硝酸钾，56g过磷酸钙，56g碳酸钙，和168g白云石。用塑料膜遮盖10-14天，每钵种25芽，每升钵混合物。除去遮蓬，把再生植株移置遮阴处，21℃／16℃，12小时光周期。视需要加施肥料溶液。再经2-4周可移栽大田。
2．复分生组织培养 采用Roca等(1978)复分生组织技术，能使单个茎尖经器官建成，从茎尖基部愈伤组织产生复芽。并可不产生形态反常的再生植株。
(1)来源材料的保存和切取茎尖
①把无病毒母株种植在防虫网室内。
②带有1个腋芽的茎切段用0．25%次氯酸钙消毒，5min，无菌蒸馏水充分淋洗。
③从腋芽解剖出长0．5-0．6mm茎尖，接种在诱导培养基上。
(2)培养基
①诱导培养基制备，MS+88mM蔗糖，2mg／L泛酸钙，0．7%琼脂，1．1-2．2μM BA，和1．5μM GA，最适荷尔蒙浓度视供试栽培品种而异。取4ml培养液倒入15-125mm试管中。
②增殖培养基制备法如上述，但不加琼脂，加0．054μM NAA，1．2μM GA和2．2μM BA。取15m1装入125m1三角瓶中。
(3)启动培养和增殖
①茎尖培养在诱导培养基上4-6周，22-24℃，荧光，10001x，16h光周期。
②诱导期末，把茎尖和基部愈伤组织(加不定芽原基)移入增殖培养基。培养在旋转振荡器上，90rpm，20001x，16h光周期，22-24℃。
③取健旺无病组织，继代在新鲜增殖培养基上，转移3次。
(4)节插繁殖
①把培养在增殖培养基上的芽切取节切段，移入MS+58．4mM蔗糖，0．8%琼脂，和0．6μMGA。2-3周内，腋芽长成再生植株。
②把再生植株移栽于混合钵土中，含2∶1粗沙和泥炭混合物。培养在相对高湿度下，22℃，60001x，16h光周期，1周。
3．花药培养 采用Sopory等(1978)，Wenzel(1981，1982)马铃薯双单倍体克隆产生单倍体的程序。
(1)供体植株的生长和制备花药
①植株栽种在温室内，18±2℃，加光100001x，16h光周期，短日照季节。为了延长开花，马铃薯芽可嫁接在番茄砧木上。采集长4-6mm芽，暗培在干试管中，6℃，3天。
②用1%次氯酸钙表面消毒芽5分钟，用无菌蒸馏水充分淋洗。
③轻轻地从芽中取出花药，接种在直径6cm培养皿中的琼脂固化培养基表面上。花药及其内的小孢子发育时期是小孢子培养的关键。一般以花药长2．0-3．5mm单核小孢子，胚形成率最高。
(2)花药培养和再生植株发育
①花药培养在MS+4．0μM BA，180mM蔗糖和0．5%活性炭，26±1℃，12h光周期，20001x。8-10天内产生多细胞结构，冲破外壁；接种19-22天后胚状体冲破花药壁。
②取出胚状体，放在MS+10%CW，1．3μM ZEA，0．09M蔗糖。
③当开始形态建成时，把组织转入MS+2．0μM BA和90mM蔗糖。培养条件与花培相同。
4．原生质体分离、培养和植株再生
A．Shepard(1980，1982)法
供体植株的生理条件、年龄、营养和生长环境所决定，是马铃薯原生质体分离和培养的最重要因素。
(1)供体植株生长
①块茎栽在湿的高压蒸汽消毒的沙中，直至芽长约10cm。
②切取芽，栽种在装
石的20cm钵中；每个用MS盐类含有二倍于正常浓度的KH2PO4和CaCl2浇肥。18℃，12h光周期，40001x白色荧光，相对湿度80%。从矮于50cm植株上取叶，带有充分扩展的顶小叶，作原生质体源。
(2)叶预处理和稳定处理
①叶表面向下放在荷尔蒙-盐类溶液上，含10．7μM NAA，4．4μM BA，每和种1mM的CaCl2和NH4NO3，暗培，温室，48h。
②用0．525%次氯酸钠表面消毒小叶15min，用无菌蒸馏水淋洗7次，用尼龙刷轻刷。
③将小叶切成直径2cm方块，培养过夜，培养在200ml盐类溶液中，加
大元素(NH4C1除外)和
铁和微量元素，培养基C(表18-2)。
(3)原生质体分离
①用100ml酶液真空渗入法预处理叶组织。酶液为0．3M蔗糖，0．1gMacerozymeR-10，2gPVP(分子量10000)，Shepard与Totten(1977)培养基A的矿质盐类，0．01MMES缓冲液，调节pH到5．6。28℃培养4h，旋转振荡器，以使原生质体充分释放。
②无菌纱布四层过滤原生质体，收集在Babcock瓶中。
③离心350×g8min，用巴氏移液管收集成浮在顶部的活原生质体。
④把原生质体放入淋洗培养基中，含
CL矿质盐类，加0．3M蔗糖(表18-2)。
⑤再离心350×g10min。
⑥收集，计数、用淋洗培养液稀释原生质体悬浮体到4×104原生质体／ml。就此培养1h，以助原生质体“调整”到CL的较高的无机盐浓度。
(4)原生质体培养
①离体原生质体启动培养的培养基是CL(细胞层)和R(保藏)(表18-2)。CL高浓度大元素盐类，有益于原生质体生存和早细胞分裂，但最初二周后生长不好。为此，设计了一种系统，在10cm塑料四方形培养皿内，分成四部分相间加CL与R培养基。每分部底部纵切三条5mm切口，以达到二种培养基间缓慢交换。用10ml溶解的R培养基加入四方阵的I和Ⅲ，3ml CL培养基含有原生质体悬浮物1．0-1．5×104／ml加入Ⅱ和Ⅳ。CL轻度固化，加0．2%琼脂，以利于使培养在24℃、4001x连续荧光2周后的原生质体产生的小愈伤组织(p-愈伤组织)转入后继培养基C。R含有
CL大元素无机盐类，和0．5mM NH4Cl，二倍水解酪蛋白，降低有机渗透剂组分(表18-2)。
②培养2周后，把小愈伤组织转入培养基C，使愈伤组织继续增殖和变绿。
③将含有许多愈伤组织的CL 1ml，铺在12ml培养基C上，装在10cm塑料板上。
④愈伤组织培养在24℃，50001x连续荧光。
⑤2周后，将各个小(0．1-1．0mm)绿愈伤组织转入新鲜培养基C，培养温度和光强相同。
⑥2周后，将愈伤组织转入培养基D，以取得芽形态建成。
(5)植株再生
①培养基D中的NAA和BA，代之以9．1μM ZEA，0．57μM IAA，和7μM ABA，促进芽形成。一般培养约4-6周后开始出现。
②把小芽转入培养基T(表18-2)，使之伸长和生根。芽发育和生长的温度和光强与愈伤组织在培养基C生长所用的相同，但生根所用光强降低到2001x。
③移裁带根再生植株入钵，装有3∶1
石和沙混合物，用稀(0．1g／1)20-20-20肥料浇，保持在生长箱内，12h光周期，50001x荧光，相对湿度60%。
B．Thomas(1981)法
此法较Shepard(1980，1982)法为简便，但只有少数马铃薯栽培品种取得成功。这是Binding等(1978)用于马铃薯双单倍体克隆法的改进程序。其特点是用芽培养体作为原生质体来源。
(1)供体植株的生长
①从生长在20℃光，16℃暗，16h光周期，230001x的生长箱内的马铃薯植株取腋芽有小部分茎。
②用1%次氯酸钠表面消毒芽(带茎)5min，用无菌蒸馏水淋洗6次。
③除去大叶、茎和坏死组织取出芽，接种在MS加0．09M蔗糖，0．6%琼脂和2．2μMBA。
④培养3-5周后，培养条件26℃，16h光周期，4001x，形成长约3cm芽。把含有一叶和腋芽的小段(长3-8mm)转入MS不加BA培养基上增殖。培养在26℃，16h光周期，10001x。3周后，从这些芽培养体分离原生质体。可加100mg／L水解酪蛋白以检测细菌或其它微生物污染。
(2)原生质体分离和培养(表18-2，表18-3)
表18-2 马铃薯原生质体分离、培养和植株再生培养基
(Shepard1980，1982)
a．CL=细胞层培养基；R=保存培养基；C=愈伤组织诱导培养基；D=芽形态建成培养基；T=芽伸长和生根培养基。
b．mg／l
c．Z-N-Morpholino-ethane sulfonic acid
d·Sigma TypeⅢ琼脂糖
e．洗过的Difco纯化琼脂
表18-3 马铃薯芽培养物产生的原生质体培养基
(Thomas，1981)
a．用于固体培养
①把芽切成1cm小段，培养在100ml酶溶液中，含有1．5%meicellase，0．1%果胶酶和0．5M甘露糖醇(pH5．6)，3h，25℃，暗培。
②培养期间用手间隙摇动组织-酶混合液，以利原生质体释放。
③用无菌不锈钢筛(孔大小：100μm和50μm)过滤原生质体悬浮体。
④原生质体悬浮体离心100×g5min，片状沉积物再悬浮在0．55M甘露糖醇中，离心100×g5min，加在甘露糖醇中的50%percoll上(取等容积的Percoll和1M甘露糖醇相混合)，从残屑中分出成活的原生质体。
⑤用巴氏移液管把集结在percoll表面上的原生质体；放在0．55甘露糖醇中淋洗和离心3次，80×g。
⑥最后片状沉积物悬浮在含0．4M甘露糖醇培养液中，密度为1×104原生质体／ml。
⑦原生质体培养在3．5cm塑料皿内(1ml／皿)，或多穴板上(每穴0．5ml)，25℃，连续光照4001x。
⑧植板后2天，用含0．3M甘露糖醇与0．4%琼脂的混合培养基，以1∶1稀释原生质体悬浮体，用植板在板或穴中，培养环境条件相同，5天。
⑨培养在20℃，16h光周期，10001x。以后2个月内，每周加新鲜培养基(0．2%琼脂)，培养体含有大量小愈伤组织。
(3)植株再生
①1-10mm愈伤组织转入MS+0．03M蔗糖，0．2M甘露糖醇，2．3μMZEA，和0．4%琼脂。培养在16h光周期130001x。培养期间愈伤组织转绿，产生芽。
②为了加速芽增殖，取芽转入MS+0．09M蔗糖，和0．44μMBA。在不加荷尔蒙MS，降低光强下，应易于生根。
(三)展望
细胞培养技术学的进展，为马铃薯改进提供着若干新途径：通过分生组织顶尖培养以消除病毒，通过原生质体分离和培养，诱导产生遗传变异分生组织顶尖培养也为优越材料的加速繁殖提供方法，以及有价值种质的长期贮存。随着人口增长压力和习生地的减少，遗传变异损失日益增多，独特遗传材料的保存，越来越是关键。用细胞培养方法长期储藏，将有助于马铃薯育种家提供所需，也可解除国际交流种质的困难，由于培养的植物，可合理地保证是无病原菌和虫害的材料。
科学家们用马铃薯愈伤组织培养物，可进行大量生理学研究，从呼吸作用到植物-病原菌互作，也可能应用于抗病育种。花药培养产生双单倍体和单倍体，继之染色体加倍，使得有可能分析育种方案。最后，诱导体细胞无性系变异和其它人工培养方法，为校正最普遍采用的品种的缺点提供新机会，例如Russet Burbank。由此可知，人工培养技术具有优越潜势，为马铃薯改进作出显着贡献。
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