杂谷
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第476页（10873字）
杂谷指种子小的许多禾谷类作物。是粮食，饲料和其它，它耐长期或间歇干旱，是干旱或半早热带作物。几种重要杂谷是：
植物学名 普通名
Sorghum bicolor(L．)Moench 高粱
Pennisetum americanum(L．)K．Schum． 珍珠粟
Pennisetum purpureum Schum． 象草
Panicum miliaceum L． 稷
Panicum mayimum Jacg． 羊草
Eleusine coracana(L．)Gaertn． 龙爪粟
Setaria italica(L．)Beanv． 狐尾粟
Paspalum scrobiculatum L． 鸭
草
(一)研究进展
1．高粱 组织和细胞培养最新发展，推动了采用人工培养技术学改进禾谷类作物的设想。其先决条件是取得相对同质细胞群体，和在特定条件下再生植株能力。但迄今成就不大，尤其是禾谷类是如此。
Strogonov等(1968)从高粱分蘖节形成愈伤组织，继而分化成茎芽。Mastellar和Holden(1970)从发芽的幼苗取得了紧密黄色愈伤组织。转移到附加IAA，2，4-D或NAA低浓度的培养基上，形成了根。但是，如果转移到附加NAA27．0μM(代替2，4-D)出现茎芽分化和继而发育成株。Rogers等(1974)取得了愈伤组织和根，但无茎芽。
Mascarenhas等(1975)诱导幼苗切段形成愈伤组织。这些培养体初期保持无组织状态，继之生根。当将生长在琼脂培养基上转到振荡中的(成分相同)液体培养基中，形态改变。愈伤组织分化产生大量根，继续生长，带有许多侧根。但是，如果转回琼脂培养基，回复成无组织愈伤组织，并就此增殖。这样的分化和回复可反复多次。
像其它杂谷一样，高粱离体培养研究最有成效的外植体是未成熟胚。Thomas等(1977)培养高粱未成熟胚，产生了大量芽和类胚结构。授粉后10-30天种子切取的未成熟胚，培养在附加2，4-D培养基上，产生了白色愈伤组织。在这些培养体里形成了大量明显类似有性胚的结构。由此发育成成百个带叶芽。以后，从2年生种子切取的胚的盾形组织上，也诱导出相似结构。
Gamborg等(1977)从授粉后12-18天切取未成熟胚形成叶芽。细胞分裂素虽非启动愈伤组织和生长所专化，但只有玉米素或2ip存在时，才形成芽。培养在附加IAA，NAA或2，4-D培养基的小块叶芽愈伤组织，取得再生结果。在保证完整植株发育，IAA证明优于NAA和2，4-D。再生植株生长到成熟，有的虽不育，其它产生正常种子。愈伤组织再生的25株中，每株的减数分裂中期染色体数2n=20，与正常植株相当。
Dunsten等(1978)得到与Thomas等(1977)的相同结果。未成熟胚盾片细胞形成的紧密愈伤组织，或直接长叶，或极像有性胚。提出了芽和胚是从盾片直接产生的，而未经愈伤组织，并进行有限的增殖(King等，1978)。Dunsten等(1979)设想高粱未成熟胚培养体再生植株的两种不同途径：普遍的是从盾片细胞产生，有些情况是从单细胞产生。附加2，4-D或NAA培养基上继代过程中，芽生长受抑制，但对侧芽形成无影响。改变生长调节剂水平，这些组织化原基发育成芽。就此可知，这些培养体与茎尖培养体相同，并以微分蘖名之。
Wernicke和Bretell(1980)报道了高粱叶培养中体细胞胚胎发生。幼叶切段接种在附加2，4-D培养基上，增殖成愈伤组织，继代到无生长素培养基上，形成芽和再生植株。延长继代后，这种愈伤组织产生体细胞胚。提出虽无组织学论据，叶愈伤组织含有增殖中原基团。培养基中的2，4-D，完全抑制着这种原基的形态学表达，转到低或无生长素培养基，这种抑制立即消除。
以后，Bretell等(1980)也观察到高粱未成熟花序切段形成类胚结构和芽原基。在附加2，4-D培养基上，表面细胞层内的有组织细胞分裂，产生紧密状组织，由此形成类胚结构(有些带有明确的芽-根轴)。这些结构发芽产生再生植株，生长成熟。用个体小花培养也观察到相似反应。
2．珍珠粟 Rangan(1976)从珍珠粟中胚轴外植体培养，当转移到不加2，4-D或低浓度生长素培养基时，取得了茎芽。发育成完整植株，移植土钵长到成熟。Bajaj和Dhanju(1981)观察到象草未成熟种子或幼花序切段愈伤组织培养体再生植株。
Vasil和Vasil(1981)用珍珠粟和珍珠粟×象草杂种未成熟胚和幼花序建成的愈伤组织培养体观察到体细胞胚胎发生和再生植株。发现授粉后7-15天花序切取的未成熟胚是供培养理想材料。胚的行为与其接种时放在培养基的位置有密切关系。面向上时(盾片与培养基接触，胚轴离开培养基)，胚过早发芽，形成弱苗。面向下时(胚轴接触培养基，盾片离开)，盾片周缘吸涨，出现许多折叠，最后形成紧密淡黄色愈伤组织。3-4周龄培养体，盾片周缘产生杯状结构。当将盾片愈伤组织或小块愈伤组织转移到无2，4-D培养基上，从杯状盾片结构中心出现管状结构，好像叶鞘。许多盾片杯和叶鞘与根相连，全部结构很象合子胚发芽的最早时期。培养每胚的盾片，产生胚胎发生的愈伤组织，由此形成组织完好胚，每胚有其自身盾片，叶鞘和茎-根轴(图20-3)。从单细胞产生体细胞胚。这些人工培养再生植株移植温室生长，根尖涂片观察到正常二倍体2n=14。
珍珠粟和狼尾草属杂种的花序切段培养附加2，4-D和加或不加椰乳的MS培养基。取得了紧密胚胎发生愈伤组织，很象盾片愈伤组织，产生许多杯状结构。转移含有ABA0．04μM+苹果酸铵2．65mM+蔗糖0．18mM培养基上，产生了组织化体细胞胚，继而发芽，长成成熟植株。
Vasil和Vasil(1981，1982)也报道珍珠粟胚胎发生细胞悬浮培养体形成体细胞胚胎发生和再生植株。未成熟胚的盾片产生的胚胎发生愈伤组织建成悬浮培养体，由大、高度液泡化细胞以及富含细胞质的细胞所组成。胚胎发生细胞含有质体和淀粉，并以四个或更多细胞为一群，偶有单细胞。悬浮培养体中有类似胚胎发生发育的各个时期。当植板在无2，4-D培养基上，含有脱落酸，产生了具有禾谷类胚典型组织的胚，发芽而成再生植株，移栽成功。这些胚显然是从单个胚胎发生细胞发育而成，或是直接地或是形成原胚团块后产生的。
Haydu和Vasil(1981)从象草叶外植体形成胚胎发生愈伤组织。从胚产生的愈伤组织，以后发育成株。组织学研究指出这种愈伤组织来源于叶肉细胞和下表皮细胞。从花药的体细胞也取得相似胚胎发生愈伤组织，并通过体细胞胚胎发生形成植株。叶和花药培养产生的植株具有正常染色体数2n=4x=28。
采用植物原生质体研究虽有相当进展，培养成功的限于胡萝卜、烟草、曼陀罗和矮牵牛，分离和培养禾谷类原生质体很困难。Vasil和Vasil(1979，1980)从珍珠粟胚胎发生悬浮培养物分离的原生质体培养和再生植株成功。这些培养体含有大、液泡化细胞和小浓细胞质胚胎发生细胞。前者的原生质体从不分裂，终于退化。但是，胚胎发生细胞的原生质体再生细胞壁，经分离和培养后，2周内形成15-20个细胞团。进一步细胞分裂，形成类似胚胎发生早期的有组织结构。4-5周内，取得了具有紧密胚胎发生细胞，当转移到无荷尔蒙培养基时，形成胚状体，进而发育成再生植株。建成细胞培养体的原生克隆和从原生质体再生见下节。
3．黍 Rangan(1974)用稷中胚轴外植体建成的愈伤组织培养体，转移到无2，4-D或低生长素(NAA，IAA)培养基，观察到茎芽。其再生植株长到成熟。Bajaj等(1981)从羊草，稷和P．antidotle胚，茎尖和花序建成的愈伤组织培养体内形成的茎芽取得再生植株。这些再生植株形态特性不同，如大小、叶形和分蘖。
Lu和Vasil(1981，1982；Lu，1981)诱导羊草未成熟胚，花序切段和叶组织取得了体细胞胚胎发生。在未成熟胚培养体中，盾片产生了紧密愈伤组织，由此形成一些杯状结构，继而分化成胚状体。人工培养形成的再生植株移栽成功。是正常四倍体2n=4x=32。有意义的是从成熟胚产生的组织，再生植株是通过茎芽成功的，继之分化不定根。
用羊草最幼1-4轮生叶横切成厚2mm小块，培养在MS附加2，4-D和CW的不同组合。发现从芽分生组织水平附近起长3厘米叶段，对诱导愈伤组织形成反应最强。1周后，叶脉吸涨，继之只有叶背下面，不是叶面(上面)出现愈伤组织。最初愈伤组织是软、透明状，约2周后，局部变成白色胚胎发生愈伤组织，在其表面出现许多胚状体。当将在2，4-D和CW培养基形成的胚状体转移到附加1mg／lGA3MS培养基上，它们成熟和发芽成再生植株。经移栽温室后长到成熟。其染色体数正常2n=4x=32。
下表皮和叶肉细胞细胞分裂产生紧密、白色、胚胎发生愈伤组织。下表皮细胞产生的周缘分裂形成放射状排列。叶肉组织内细胞分裂，限于叶下半部细胞，尤其在维管束二边。
Lu和Vasil(1981)也用羊草未成熟胚和幼花序产生的胚胎发生愈伤组织建成的悬浮培养体取得了体细胞胚和再生植株。悬浮培养体由二类细胞所组成：小、细胞质浓，常含淀粉的胚胎发生细胞和大、液泡化非胚胎发生细胞。其中看到单个胚胎发生细胞，形成胚状体的各个阶段，直至分化的侧面峡谷。将悬浮细胞植板在琼脂培养基上，只加2，4-D0．9μM，形成了充分分化的胚状体，发芽而成再生植株。无论是未成熟胚和花序切段产生的胚胎发生悬浮培养体再生植株是正常体细胞染色体数。从胚胎发生悬浮培养体分离的原生质体，培养产生了胚胎发生愈伤组织、胚状体和再生植株，也取得成功(Lu等，1981)。
4．龙爪粟 Rangan(1976)培养龙爪粟5日龄幼苗中胚轴外植体，在低生长素培养基产生了根，但生长素较高时，产生黄色结瘤状愈伤组织。转到无或低生长素培养基，愈伤组织发育茎芽，切离转移产生再生植株。后者表现未熟分蘖和开花，可供移栽，生长成熟。
5．雀稗
像指粟一样，用鸭
草中胚轴外植体建立的体细胞组织培养，转到无或低荷尔蒙培养基发育成茎芽附加KIN或SD8339(6-苯甲酰-9-四氢-吡喃腺嘌呤)等细胞分裂素，对诱导茎芽效果显着改进。再生植株移栽成功。
(二)培养程序
1．珍珠粟细胞悬浮培养体建成
(1)珍珠粟种子在1%琼脂上无菌发芽。
(2)3日龄幼苗取下胚轴接种在LS琼脂培养基附加2，4-D 11μM+NAA 5．4μM+KIN4．7μM。暗培27℃。
(3)2周内下胚轴将产生松散愈伤组织。每隔4周用新鲜培养基继代一次。
(4)把愈伤组织放入35ml液体培养基中，启动悬浮培养体。振荡150rpm，暗培。
(5)一经建成，每4天把悬浮体继代。
(6)也可从未成熟胚的或花序产生的愈伤组织建成细胞悬浮培养体。用授粉后10-20天的未成熟胚培养。取个体花原基刚开始形成时取花序切段培养。这些组织培养在LS附加2，4-D 11．3μM+CW 5%培养基中。采用未成熟胚盾片或幼花序切段产生的愈伤组织以开始细胞悬浮培养，每5-6天继代一次，暗培，27℃，振荡150rpm(Vasil和Vasil，1980，1982)。
(7)另一方法，也可用Guinea草未成熟胚或幼花序产生的愈伤组织启动细胞悬浮培养(Lu和Vasil，1980；Lu等，1981)。
2．珍珠粟和Guinea草原生质体分离、培养和再生
(1)分离原生质体前1周，每隔2天继代细胞悬浮体。这样可增高悬浮体中的胚胎发生细胞密度和减少增大的厚壁细胞。
(2)取0．75-1．5ml细胞悬浮体与8-10ml酶溶液(2%Onozyka R-10 Cellulase，0．15%Pectolylose，0．25%Driselase，0．5%Rhgzyme，0．15山梨糖醇，0．15M甘露糖醇，7mM CuCl2·2H2O，0．7mM NaH2PO4·4H2O和3mM MES缓冲剂，pH5．6)。
(3)25℃，培养在旋转振荡器上，6rpm，4-6h。
(4)用Miracloth过滤原生质体制品，再加100μM和50μM不锈钢滤器，除去未消化细胞和残屑。
(5)将滤过物放入Kao和Michayluk(1975)改进营养培养基中(Vasil和Vasil，1980)，附加葡萄糖0．3M+2，4-D0．9μM+ZEA2．3μM，用离心法(100×g，3min)洗3次。
(6)原生质体培养在改进的Kao和Michayluk培养基的液悬滴上的薄层中，用石蜡膜封培养皿。27℃暗培3天。4天后产生第一次分裂。
(7)7天后，在原生质培养体中加新鲜培养基，以后每3-4天加一次。
(8)3周后将再生的愈伤组织块和胚转到MS琼脂培养基，附加2，4-D1．1-4．5μM。在无荷尔蒙培养基上胚状体发育成再生植株。详见Vasil和Vasil，1980和Lu等，1981。
3．珍珠粟，象草和羊草启动体细胞胚胎发生
(1)未成熟胚，幼花序切段和幼叶小块在附加2，4-D培养基上产生软易碎非胚胎发生愈伤组织以及紧密胚胎发生愈伤组织。
(2)从软易碎愈伤组织建成悬浮培养体，由此分离出原生质体产生非胚胎发生细胞无性系。
(3)紧密胚胎发生愈伤组织形成胚状体，它在低生长素培养基上分化、发芽，终于长成成熟植株。
(4)由胚胎发生愈伤组织建成悬浮培养体也能保持胚胎发生的，当植板后，形成带有胚状体的胚胎发生愈伤组织。
(5)从胚胎发生悬浮培养体分离的原生质体，形成带有胚状体的细胞克隆，发芽和生长形成再生植株(见图20-3)。
图20-3 珍珠粟、象草和羊草的体细胞胚胎发生图解
(三)结论
由于植物细胞培养技术有助于作物的改良，鼓起最近热潮。但是，经常讨论的问题是，获得从单细胞再生植株能力。
禾谷类和草类若干重要种培养的组织曾取得再生植株成功。一般是从茎分生组织的再生，来源于多细胞。但是，这类再生不仅是偶见的和短暂的，也可能形成嵌合体和混倍体植株，不适于遗传研究。另一方面，通过体细胞胚胎发生而再生，将是有利的，好像从单细胞产生胚。双子叶中体细胞胚胎发生较普遍，单子叶则例证极少。所以，最近报道禾本科的体细胞胚胎发生有很大鼓动作用。
Vasil和Vasil(1981)提出从禾谷类和草类取得体细胞胚胎发生，不像以前相信的那样少见和困难。许多种的未成熟胚、幼花序和幼叶产生的愈伤组织，细胞悬浮体和原生质体培养成功地形成胚和植株再生事实，支持着这种观点。
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