草莓
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第582页（12584字）
罗马在公元前栽培草莓。中世纪盛产于英国。是从北半球野生草莓(Fragaria vescaL．)产生的，果实小。现代草莓果实大，是F．chiloensis Duch．和F．virginiana Duch．杂交产物。它是八倍体，以F．ananassa Duch．名之。现代品种生长于二种不同气候区域：一类适应于septentrional栽培，即秋短日冬寒，另一类适应于meridional条件，即秋长日冬暖。草莓用于加工业和鲜果。近代改进目标是日长中性品种和现代革命性栽培技术。
(一)草莓改良
1．应用组织培养 曾采用过几种组织培养方法。如快速无性繁殖，种质保存，用花药培养产生单倍八倍体和多单倍体。可惜，没有取得所期望的染色体数减少效果。
2．抗逆性改进草莓常受病毒和支原体病为害。包括mild yellow edge病毒，晚疫A病毒。土壤真菌如Phytophthora fragariae造成的红心(red core)，或phylopbthora cactorium或Verticillium sp．造成的“萎缩”病。由于受害病株在开花后发病，苗圃治病有困难。其它如寄生昆虫：Tarsonems和线虫。药剂防治效果不好。为此利用分生组织培养和微繁殖以创造健康母株，日益增多。
(二)研究进展
1．分生组织培养 1962年首次采用草莓分生组织培养。Belkengren和Miller(1962)应用此法消除了F．vesca的晚疫A病毒，Miller和Belkengren(1963)消除了庭园草莓的一种病毒。显然草莓组织培养早期着重于消除病毒。
(1)消除病毒 Posnette和Jha(1960)用热处理植株微插枝(mini-cutting)消除病毒。从经热处理植株树冠切取小侧芽，可消除部分病毒。Miller和Belkengren(1963)切取蔓顶尖长3-5mm，放在无菌培养条件下，消除了病毒复合体。McGrew(1965)防治病毒依赖于热处理时间和切尖大小。他消除了栽培品种Suwannee的晚疫C病毒。35℃处理15天后，2mm或更长些的蔓尖，生长在无菌培养基上，仍有感染。但从保持在35℃下25天的植株上取长2-6mm蔓尖，取得一些无病毒植株。
特别适用于改进的培养基，可用于较小于1mm的外植株，消除病毒效果更有效。目前用足够小的蔓尖，消除率可达100%。Hilton等(1970)许多研究者还主张在切取分生组织前，热处理植株。
最近Mcgrew(1980)证实了在无细胞分裂素存在下，分生组织大小与其生存率有直接相关；可是，他报导了分生组织大小与病毒消除率是负相关。0．1mm外植体不能成活，0．2mm的有10%成活，其中100%产生无Pallidosis病毒植株。0．5mm的有50%成活，但病毒消除率降至95%。1．0mm的成活70%，病毒消除率只有50%。所以常用0．5-0．9mm分生组织，以取得最高无病毒植株数。Megrew报道了消除crinide，mottle和veinbanding病毒取得成功。Sobczykiewiez(1979)消除了mottle病毒，但当同时受mottle病毒和皱缩病毒侵染时，消除率低。他们二者在培养基中都未加细胞分裂素。分生组织培养也对消除抗热族系的皱缩病毒有效。这种组合特别有效。经热处理疗法后，几年未有病征复现。分生组织消除病害主要文献列如表23-1。
表23-1 影响病毒消除因素
a．分子=无病毒植株数；分母=供试植株数
纵使热预处理并非病毒消除所必需，学者们强调增温对生长增强的重要性。Mullin等(1974)，Sobczykiewicz(1979)和Vine(1968)从热处理植株切取的分生组织生长比未经热处理的为快。前者生存比率较后者高(表23-2)。Oertel(1981)报道热处理的分生组织繁殖率高度增长，当移栽苗圃时，匍匐枝产生表现有利效果(为未处理对照匍匐枝的146%)。
表23-2 在热处理的对未热处理的母株上取分生组织取得的带根再生植株百分数
(2)消除其它寄生物 线虫和farsonems是外界寄生虫。可用消毒启动材料或切取分生组织时除去外部组织消除。土壤真菌，Phytophthora或Verticillium，处在植株组织里。Molot等(1973)说Phytephthoa位于较幼匍匐枝尖内，最可能在顶端下的细胞里。必需用小于0．5mm外植体予以消除。细菌克隆常发现于近顶端处，与孢子囊或Phylophthora菌丝在一起，结果使组织培养体发生污染。
(3)选择外植体、消毒和转移 从母体上切取供试规定的分生组织对植株再生能力无影响。但是以幼匍匐枝尖比发育充分植株为易。从休眠或冷藏植株取分生组织，大都有内部侵染。McGrew(1980)指出约20%受细菌污染。其污染率与栽培品种和生长季节有关。Boxas(1981)培养3000个分生组织，有74个受侵染。
匍匐枝尖放进0．1-5%次氯酸钠溶液消毒5-20min。有人用次氯酸钙。有时，事前，有必要先用70-100%乙醇浸一下。Damiano(1980)用0．5%merthiolate消毒。用Difco抗生素片也能控制细菌污染。
在低倍显微镜下用细眼科用工具和刀片切取分生组织。McGrew(1980)从分生组织以下部位夹住匍匐枝，切取薄横切小片，包括茎尖圆顶和1-2个胚叶。由此控制外植株大小。
(4)选择培养基 Knop或MS培养基最常用于草莓分生组织。Van Hoof(1974)认为矿质盐类溶液很重要。用此取得80%成功，White培养基上10%，Vine培养基A上31．5%和Vine培养基B上78%。BA是成功的基本因素(表22-3，22-4)。
表23-3 分生组织培养和微繁殖用培养基成分
a．改进的White(mM：Ca(NO3)2·4H2O 2．12；MgSO4·7H2O 0．5；KH2PO40．92；(NH4)2SO40．95；KCll．67
b．微量元素McGrew(1980)(μM)：MnSO4·H2O473．6；KI361．5； CoCl2·6H2O21；Na2MoO4·H2O 10．25
c．大元素Van Hoof(1980)(mM)：MgSO4·7H2O0．60；Na2SO43．17；KCl4．08；(NH4)2SO40．59；Ca(NO3)23．41；KNO33．68；NaH2PO44．16；NaNO32．82；NH4NO32．06；CaCl21．16
表23-4 细胞分裂素对分生组织尖培养的影响
品种差异是决定成功率关键。在Gemblowx培养的253个栽培品种无一失败。栽培品种Suprise des Halles成功率常在85-100 %，而cv Gorella是最难于培养(15-20%成功)。欧洲和加利福尼亚栽培品种、常年与季节性结果或二倍体与八倍体间无差异。
(5)培养条件 最先学者(例如Belkengren和Miller1962)采用暗培8天，移至光培。当再生植株高1cm时，移至White培养基。McGrew(1980)和Sobczykiewicz(1979)在培养基不加细胞分裂素，用此直到生根。Sobczykiewicz(1979)需要培养2或3月，取得带根再生植株，具有3-5叶。其他学者采用培养4周后把再生芽转移到生根培养基(无CW或BA)。可是，Adams(1972)为了生根，转移到附加BA 0．44μM新鲜培养基上生根。Boxus等(1977)注意到保持在启动培养基上1月以上的分生组织失绿，继而生长率降低。Van Hoof(1974)在不加BA和腺嘌呤的培养基上生根较好。
照光时间、光强和光质尚未经仔细研究。Sobczykiewicz(1979)和Van Hoof(1974)用3000 lx，Mullin等(1974)用冷白荧光2000lx和Boxus等(1977)认为1000-1500lx已可满足。Belken-gren和Miller(1962)保持连续光照。各实验室所用日长不同，Mullin等(1974)18h，Van Hoof(1974)12h，其他学者用16h。栽培品种Ostara在长日下生长较好，每瓶再生植株平均数较多。
生长室温度也影响结果。Adams(1972)25℃不是19℃取得成功。Boxus等(1977)24℃较好，Mullin等(1974)保持27℃。另一方面，Van Hoof(1974)用20℃，Navatel(1979)和Sobczykeiwicz(1979)培养体保持在23-25℃。所以，适用于草莓分生组织培养平均温度为20-25℃。
(6)长期贮藏 曾提出了几种长期贮藏方法。最近，Kartha等(1979)取得了草莓分生组织深冻保存初步结果。从预培养在附加5%二甲基磺砜作为深冻保护剂培养基上的再生植株切取分生组织。把它贮藏在液氮中1周，95%成功。样本的冷冻速度应为每分钟下降0．84度。液氮贮藏8周的再生植株频率55%以上。Sakai等(1978)从贮藏在－196℃中的离体匍匐枝尖取得了完整植株。
Mullin和Schlegel(1976)50个栽培品种再生植株贮藏在小玻璃试管的滤纸桥上，装有2．5m1培养基，石蜡封口，达到6年。暗培，4℃。在贮藏期间，每3个月加一或二滴培养基。加培养基较多，会杀死再生植株。McGrew(1980)采用相同方法，但用光培，4℃。Boxus(1974，1975)将再生植株保持基础培养基上，放在光强很低的生长室里。12-18个月后，转移到新鲜培养基上。
(7)移栽土中 草莓再生植株通常很易移栽。成功率约95-100%。经用自来水洗去琼脂后，将植株移入泥炭混合物中，盖以塑料膜，2周保持足够湿度。如果生长温度高，幼株生长很快。5-6周内，植株可有3-5三小叶叶，和强大根系。即可移入大田。McGrew(1980)估计移至温室的植株(生长在土中)，以及继后的病毒检测，至少需时3个月。
Mullin等(1974)报道当移出试管之初，幼株很敏感，必需小心操作。Molot等(1973)报告移栽土中会有显着损失。Damiano(1980)认为最好的驯化基质是纯洁泥炭，或沙和泥炭1∶1混合物。基质pH重要，pH5．6-5．8结果最好。
2．微繁殖 Boxusl974年首次完成了人工培养大量繁殖草莓植株。5年内普及于欧洲。德国首创草莓微繁殖工业。1976年，草莓育种家Reinhold Hummel创建了实验室，能生产成百万株草莓。北意大利合作社即将建立较大生产单位。同时，法国草莓苗圃(The Ets J．Marionnet of Soing en Sologne)宣告成立自己的组织培养实验室。
除上述私人实验室外，政府实验室也添置了半工业水平设施。法国CTIFL(Centre Te-chnigue Interprofessionnel des Fruits et Legu mes)在Balandran的实验室，西班牙Ganbloux的果树蔬菜研究站。
这种方法基本原理很简单。培养基加细胞分裂素诱导休眠侧芽生长。除去细胞分裂素以利叶和根发育。其最适因素有待研究。
(1)启动材料 常用分生组织取得无病材料。也能用花药培养。每个培养的花药产生再生50-100再生植株的愈伤组织。用花药培养曾消除了mottle，皱缩和mild yellow edge病毒。这种技术比常规分生组织培养方法更简便。由于植株是从愈伤组织再生的，其遗传稳定性应予控制。
(2)繁殖原理 西班牙、法国和意大利将分生组织产生的再生植株储存在基础培养基上，用作大量繁殖的起始材料。再生植株经抑制老叶和根生长后，放在加BA 4．4μM基础培养基上。3或4周后，在最老叶叶柄基部出现2-3芽。生长很快，产生新侧芽。几天内，起始用的再生植株转化为大批芽，常无愈伤组织。6-8周内，芽长到直径3-4厘米。此时这种芽簇可能带有15-25发育充分的芽。经无菌下分开后，移至新鲜培养基。在加BA培养基上，侧芽仍能增殖。可无限制地反复进行。不到一年能取得成百万个芽。最后移至不加BA培养基上，新侧芽产生立即终止，已有芽很快生长，产生新叶，逐渐长成三分小叶。12天后，生根，由此4-6周后，可将带根幼再生植株移栽土中。
Boxus等(1977)报道供试77栽培品种的反应，与野生草莓的相同。Navatel(1979)未报道过人工培养下栽培品种的生芽能力与其大田繁殖能力间有什么相关。
(3)培养基 都用相同基础培养基：Knop大元素，MS微量元素和维生素混合物，葡萄糖0．12M，琼脂7g／l，pH5．60为了促进产生侧枝，附加BA 4．4μM，IBA 4．9μM和GA0．3μM。附加IBA 4．9μM培养基上生根。
矿质元素用量稍有改变。Zuccherelli(1979)用KNO39．89mM，是Knop的4倍。Damiano等(1979)在基础培养基加KNO34-8mM，改进了栽培品种Aliso生长率。他们(1979)又报道只有加柠檬酸或琥珀酸时，NH4+盐能以利用。
研究了荷尔蒙平衡。Waithaka等(1980)培养基加高浓度(50μM)KIN，可打破侧芽的休眠。James和Newton(1977)用栽培品种Gento测验了一系列IBA和BA浓度。得出结论0．25-2．5μM细胞分裂素与0．25-1．0μM生长素相配合，促进不定芽很快增殖。为了保持高质量侧枝，Damiano(1980)用降低BA用量的培养基培养栽培品种如Aliso，Rabunda和Redgauntlet。
为了生根，每升培养基加1或2g活性炭，促进着芽和根伸长。作者观察到用加活性炭0．5g／l培养栽培品种Gembloux得到同样结果。例如，用了活性炭，栽培品种Radunda的商品级再生植株增高30%。Navatel(1979)曾建议用活性炭代替GA。Sampet指出2．88μMGA，不仅促进节间伸长，对根发育也有抑制作用。间苯三酚存在下，也能降低根的启动，但能促进形成侧根。
(4)冷藏 再生植株储存在黑暗中1-2℃，以供全年均匀生产。可取任何发育时期植株贮存，达几个月。冷藏的成果视栽培品种和贮存材料旺势而定。贮存结束时，在转移到新鲜培养基前，必需清洗再生植株。Alisa，Gorella或Tioga品种曾贮存16-17个月，在恢复良好繁殖率前，要转移2或3次。
(三)成批繁殖工业程序
过去十年中，曾培养美洲、亚洲和欧洲的350个栽培品种3731个分生组织。成功率约74%，细菌污染7%o亚、欧洲的污染植株的病毒消除100%o大部分储存在25×150mm试管中，2℃。用塑料膜封管口，以防干燥和污染。这种种质常用于繁殖。
1974年开始建立适用于工业程序的标准繁殖方法。无菌材料放入装有150ml培养基的直径10cm瓶中。可产200-500芽或45-100带根再生植株，视供试栽培品种而定。培养基可专用于培养基制备的洗机中制取。1h可煮沸40L培养基，分装250瓶。
全部栽培品种都用同样的改进培养基。Navatel(1979)提出品种间差异，可用改进培养技术以部分克服。大芽栽培品种(如Bravo，Pocahonate，Sequoia，Scietta)无需特别注意。每瓶接种有3-5芽的15外植体。1个月后，每瓶的植株(芽)可分装5瓶。芽很大的(如Douglas，Gento，Tuft)深插琼脂中。继代时必须把切端愈伤组织除尽。芽小的(如Os-tara，Rabumda，Redgauntlet)繁殖率高，但许多芽会在移时损失。就这些外植体而言，采取密切接触琼脂表面的基部芽为好。继代间隔时间不重要。
有些栽培品种如Aliso，需要最适培养条件，才能良好发育。如果温度稍高，很快老化。储存温度视材料发育状态而定。
大量生产需考虑贮存能力。一个工作者每天生产约4000株。培养室应在每年生产8个周期。每平方米每年可生产25000-30000株。
运送苗圃前，从瓶中取出再生植株，用水清洗。分株装箱，每个轻质塑料箱(10．5×8×5cm)装200株。泥炭小团也很适用。每个装有40000再生植株的箱仅重40kg。可惜，在2℃下，塑料箱不能超过4-6周。在运送前，植株储存时间不能过长。
(四)草莓分生组织培养程序
1．从幼匍匐枝尖取分生组织，用5%次氯酸钠消毒5-20min。蘸一下70%乙醇，有时有利于不同材料。
2．在解剖镜下，用细刀片切取分生组织尖。将远离分生组织区域的部位夹住，切取薄横切小片，包含有枝尖圆顶和1-2个叶原基。
3．分生组织接种在基础培养基上(Knop大元素，MS微量元素，MS维生素，葡萄糖0．12M，琼脂7g／l，pH5．6)加BA4．4μM。
4．培养体培养在20-25℃，光强1000-3000lx(日长12-18h)。
5．3-4周内，最老叶叶柄基部将出现2-3个芽。从这种侧芽将产生许多芽。当见15-25发育良好芽时，无菌分开，放在根培养基上(不加荷尔蒙的基础培养基)。
6．12天内可见根再生。洗去根际琼脂移栽土中，把移栽钵放在高湿度环境中。
(五)微繁殖植株的大田状态
1．结实情况 自1974-1978年开始微繁殖植株(micrpplant)大田试验以来，到1981年，已在英国、西班牙、荷兰、意大利、瑞士等国开展了这项工作。基本结果是微株与相同基因型和无病对照植株分生克隆栽培品种没有差异，有些品种的微株的果实较小(如Redgaun-tlet，瑞士Gorella，意大利)。Gorella无性系户外冷藏植株表现直立特性和矮株(经极端高处理的也是如此)，多叶、叶柄较短、叶面积减小等。2℃冷藏几个月的植物大小正常。同样处理的Sivetta也是如此。一致证明长期冷藏能改进微株结实数量和品质。为了对这种方法作出全面评价，重要的是评价不同栽培品种、冷处理时间和继代次数。人工培养繁殖的新草莓杂种，经常表现产量很高，果实很大。Lemaitre(私人通讯)观察到15个栽培品种经4或5次继代取得的微株，产量和品质均有所改良。Domanil(美国)第三代后，果实恢复正常。Tioga微繁殖株产量较高。较热地区微株冬抑，倾向于开花繁茂，结小果实。改进微株产量的另一可能方法，是改变人工培养条件，即改变培养液的荷尔蒙平衡，或植株的生长条件。Naumann(1979，1981)初步试验指出，在特殊日周期和温周期下产生的再生植株的产量，比对照植株高96%。
2．匍匐枝生产 微株移栽土中3周，在长日下(14h)产生第一匍匐枝。可能由于微株的幼年状态，产枝能力增高62%。组织培养植株的单小叶现象，移栽后很快消失。栽培品种Bordurella是无匍匐枝品种，产生5-7匍匐枝，然后停止。这种行动象一种相的转变，从幼年转到成年。
Schwarz等(1981)认为采用微株生产，应产生植株一致性较高和大田成活率高的结果。Damiano等(1980)指出微株后代虽非免疫，但并不比传统繁殖植株更敏感。法国自广泛种植微株，枯萎病几乎完全不见了。Sansavini等(1980)栽培品种Gorella的组织培养产生的植株，病害(collasso)被抑制。Lemaitre(1979)指出微株繁殖效率较高。
Banyard指出草莓遗传结构很稳定。这就说明了草莓很少发现突变。微株的常见遗传变异是，绿黄花叶类型。“六月黄”包括黄斑、嵌合体或白色条纹。Earliglow的产生率为8．4%。黄色扭曲叶。Sansavini和Gherardi(1980)观察到一种反常类型，同时产生花和匍匐枝(一般植株的生殖和营养阶段是分期发生的)。此外Boxus等还观察到矮株，许多小叶和大量树冠和花，这些特性与继代次数有关。果形也发生变异。
这些变异可能是微株生长期间由特殊生理条件所引起的变异体。Soede(1981)建议微繁殖(Nephrolepis exalta)时降低盐浓度。能完全抑制矮株习性。这是第三次继代后经常发生的。Zimmermann报道叶上长不定芽。最近，Boxus等在Gembloux也观察到叶上长不定芽，但它们一般败育。
(六)结论
草莓微繁殖虽有困难，但可产生高质量植株。为取得最高生产量成功，必须观察：
1．用分生组织启动，用指数核查结果。
2．消除全部愈伤组织和不定芽的形成。
3．有规律地更换培养母株，以保证大果高产，避免惯生现象(habituation)。
4．视栽植区和供试栽培品种的健好条件，用微株进行一或二次传统繁殖。例如长期结果栽培品种应繁殖一次。
采用这些条件，进程速度和取得质量植株，将能达到最高效果。
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