胡萝卜
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第547页（20430字）
胡萝卜(Daucus carota L．subsp．sativus(Hofbm．)Thell．)属伞形科，是寒地生长植物，最适生长温度15-20℃。栽培胡萝卜是野生胡萝卜(D．carota L．subsp．carota)的类型。胡萝卜属(Daucus)有80个种，半数是胡萝卜种的亚种或类型。染色体数25左右，基数范围n=7-n=11。是二倍体n=9，有多倍体种，多倍体性和染色体结构改变是种分化的主要因素。是典型二年生，虽有一年生类型。胡萝卜是世界第七种蔬菜作物。是异交作物，自交后严重退化。育种目标：选择雄性不育系，生产F1杂种，其它主要目标是产量、根形和色泽、早熟性、地上部根比率、抗病性和质量特性等。
(一)研究进展
1．愈伤组织启动 采用胡萝卜根首创非肿瘤植物细胞培养。同年White(1969)报道了粉蓝烟草×长花烟草异种间杂种遗传肿瘤的生长。这些培养体培养和保持在Knop溶液加Berthelot氏的盐类、葡萄糖、白明胶、硫胺素、盐酸半胱氨酸和IAA。胡萝卜愈伤组织可在这种培养基上保持多年，生长率无明显下降，偶见木质化细胞作为唯一分化征象。胡萝卜组织对生长诱导的反应性，使之成为研究促进细胞分裂因子的典型体系。
2．胡萝卜培养体的形态建成 Nobecourt(1939)报道胡萝卜主根组织愈伤组织出现根。愈伤组织可生长在液体培养基中，如悬浮培养体。生根较多，芽也有发育频率较少。Ste-ward等(1958)研究悬浮培养体，Reinert(1959)用半固化培养基研究愈伤组织培养体，描述了从胡萝卜组织的体细胞胚发育和最后长成植株。Steward用加CW的培养基，产生了多细胞团。如果多细胞团保持在培养液中，形成根分生组织和生根。如果在根生长前，把多细胞团转移到琼脂固化培养基上，产生了很像发育中胡萝卜胚的“分生组织瘤”，出现芽和叶。Reinert(1959)把胡萝卜愈伤组织培养在加7%CW和57μMIAA培养基上，如果把组织转移到无生长素培养基上或让其在同样培养基长期生长，看到根形成。但是，愈伤组织在复杂培养基上保持数月，其结构和形态改变；外层被有“蜂窝状瘤”，仔细观察表现“正常双极胡萝卜胚”。
3．体细胞胚胎发生 胡萝卜培养体内体细胞胚发育很像合子胚胎发生，常表现相同发育顺序，经球形、心形、鱼雷形和子叶期。像合子胚，它们来自单细胞。在小体积液体内能产生大量体细胞胚，由此可得大量植株。
悬浮培养物是胚原和非胚原细胞和细胞簇的混合体，其大小和数量不同。在历次继代期间，培养体变成仅有非胚原细胞组成，因此失去产生体细胞胚和植株能力。当胚开始成熟时，原胚大小不同，结果体细胞体群体发育不同步。此外，发育正常途径可能有变化，产生一系列结构畸变。这些是后生变化，其中能产生正常胡萝卜植株。
自从Steward和Reinert独立发现体细胞胚胎发生以来，胡萝卜培养物已成为研究植物细胞培养许多观点的典型体系，尤其是形态建成，和体细胞胚胎发生、细胞突变体选择，和通过原生质体分离-融合技术的体细胞杂交。最近花药培养技术应用于作物。
4．影响胡萝卜体细胞胚胎发生的因子 最早成功是在附加CW或椰子水培养基取得的。以后研究指出诱导胡萝卜培养的胚原生长和促进成熟，能在完全规定不加CW培养基完成。在早期研究中证实了胡萝卜体细胞胚胎发生的基本要求：(1)生长素或类生长素物质是胚启动的关键，降低用量或不加能有助于成熟，和(2)还原氮对启动和成熟是重要的。
(1)还原氮 Steward和Reinert最早取得胡萝卜体细胞胚是以复杂培养基附加CW和水解酪蛋白，二者都是还原氮之源。Halperin等(1965)报道了铵的特殊要求。Ammirato(1983)指出用于诱导体细胞胚胎发生的大多数培养基含有硝酸铵。还原氮源有多种和复杂附加物(例如CW)，氨基酸混合物或单用。在加有硝酸盐时丙氨酸和谷酰胺是优越的。培养基不加硝酸盐，谷酰胺比其它氨基酸单用为好，如果能保持pH值，铵可作为独一氮源。研究内生氨基酸水平变化指出，在胚成熟期间，谷氨酸和谷酰胺在胡萝卜细胞内有积存．但丙氨酸不是如此。丙氨酸在促进体细胞胚胎发生优于铵，占着氨基酸代谢的中心位置，很有可能在胚发育期间转化成其它氨基酸。限制还原氮用量，可能是控制同步性的一种途径。
最近，Stuart等(1984)指出脯氨酸有益于紫苜蓿体细胞胚胎发生，并依赖于铵水平。在一定浓度时，能改进成熟胚“性质”，即产生更正常结构，发芽水平较高或胚转变成再生植株。胡萝卜悬浮中加脯和丝氨酸促进生长，但能明显改变胚的正常发育。
胚原细胞与非胚原细胞相比较，多胺水平较高，尤其是丁二胺和亚精胺。精氨酸作为多胺合成前导物，其水平与精氨酸去羧酶活性是重要的。抗抑制剂5-氟尿嘧啶的细胞系，再生差，在增植生长期间显着缺少精氨酸。在有2，4-D和精氨酸时，用丁二胺处理细胞悬浮体，产生球形胚，当转移到无2，4-D和丁二胺培养基时，不能继续发育，但把它转到无精氨酸培养基确能发育。Feier等(1984)用二氟甲基精氨酸(多胺合成抑制剂)能抑制胚胎发生。一种突变体细胞系在胚原培养基上生长率与野生型相同，不出现在胚原培养物中亚精胺和精胺水平增高这样的特性。此外，外源2，4-D阻止胚成熟，但对悬浮体增殖无影响，对多胺生化合成酶活性、精氨酸脱羧酶和S-腺苷甲硫氨酸去羧酶有抑制作用。增多多胺对胚成熟有特效，而不是细胞生长。
(2)其它无机营养源 除氮外还要其它无机盐类，如相对大量(大元素)的如钾、镁、钙、硫(常用硫酸盐)、磷(磷酸盐)和铁。常用钠和氯化物。微量元素如铜、锌、锰、硼和钼。胡萝卜细胞培养特别需要钾离子和磷酸盐。
(3)碳水化合物 许多单糖和双糖能支持胡萝卜体细胞胚的启动和发育。以蔗糖最有效，应用最广。葡萄糖也有优越碳源。增高蔗糖水平，加己糖醇如肌醇或山梨醇增高渗透压，能防止过早发芽，但有增高次生胚或辅胚形成倾向。最近，增高培养基渗透剂用量引起外植体细胞质壁分离，加强体细胞胚胎发生。加多肌醇和减少蔗糖，防止过早发芽和格外增植。ABA也能影响体细胞胚发育的控制。
(4)生长调节剂
①生长素：体细胞胚虽能在无外加生长素时从外植体细胞产生，特别是胚原细胞，生长素是启动胡萝卜体细胞胚胎发生的重要成分。许多生长素能促进胚原细胞增殖，如IAA，NAA，和2，4-D。但较强生长素如2，4-D特别有效。生长素对启动胚原生长显见重要，但抑制胚原成熟。
常用程序是把细胞移入无生长素培养基，含较低浓度生长素，或含不同生长素(常用较低浓度)。但野生胡萝卜悬浮体，用新鲜培养基稀释时，由此降低细胞密度到每毫升2×104细胞，2，4-D有可能产生大量球形胚。但这些胚不能进行达到成熟的所需阶段。
②细胞分裂素：无外源生长调节剂培养基上，胡萝卜体细胞胚能充分成熟，如果密度是正确的。但是，加生长调节剂有利于发育，尤其在某些参数内。曾指出细胞分裂素是胡萝卜体细胞胚发育所必需，尤其是子叶发育。如不是为了生长，其存在能刺激畸形成熟，如葛缕子培养体。它能对抗ABA的生长抑制效应。细胞分裂素类型可能是重要的，例如，ZEA而不是BA或KIN有益于胡萝卜胚胎发生。
在密度低时，原胚不能成熟，ZEA可促进葛缕子低密度培养体成熟，与ABA配合更为有效。ZEA与NAA配合促进从胡萝卜原生质体产生的细胞直接产生体细胞胚，而不经愈伤组织阶段(Dudits等，1976)。
KIN虽非生长所需，在长期培养体中，能保持胚形成潜力。Chandra(1981)在胚原和非胚原系对比试验中，当将培养在高水平KIN(9．3μM KIN+0．45μM 2，4-D)的非胚原细胞转到无2，4-D培养基上，产生体细胞胚胎发生。如果将其保持在胚原细胞标准培养基上(0．93μM KIN+0．22μM 2，4-D)，当移入无2，4-D培养基后，只形成根。而胚原细胞易于形成体细胞胚。
③赤霉素：胡萝卜体细胞胚胎发生很少用这类生长调节化合物。GA3能抑制胡萝卜悬浮培养体的胚胎发生。但在葛缕子体细胞胚培养中，GA3与ABA配合能促进胚成熟，与ZEA和ABA互作能节制发育过程。
④脱落酸：这种自然产生生长抑制剂有选择地抑制胡萝卜体细胞胚胎发生期间某些器官建成事项。ABA也影响体细胞胚成熟。抑制反常胚发育，包括子叶畸形；阻制胚启动新中心形成；和抑制过早发芽。对小球形早胚正常发育程序无抑制作用。可知ABA助长正常胚成熟。
⑤反生长素：2、4，6-三氯苯氧乙酸和ρ-氯酚异丁酸抑制胡萝体细胞胚胎发生。但反生长素的反应，发生于胚胎发生早期，此时幼胚对生长素也敏感。由于当将胚移入无生长素培养基时，发生胚成熟，观察发育后期的反生长素效应是有价值的。
⑥活性碳：活性碳能促进胡萝卜培养体的体细胞胚发育，甚至当除去生长素后不能产生体细胞胚时。能降低培养基中加的苯乙酸和ρ-羟苯甲酸(抑制体细胞胚胎发生化合物)。也能吸收5-羟甲基糠醛(蔗糖高压蒸气消毒时降解产物)和过量的生长素和细胞分裂素。活性碳吸收抑制剂，无论阻止生长和生长促进剂，促进增殖而非组织化发育。
⑦乙烯：这种自然发生的生长调节剂，抑制胡萝卜体细胞胚胎发生的启动。最近研究指出胚原野生胡萝卜悬浮培养体未见乙烯，加低水平(1-10μM)启动乙烯合成的1-氨基环丙烷羧酸，加强胚成熟。
(5)环境因子
①光：体细胞胚胎发生于高光、低光、完全黑暗和各种光周期。一个试验中，完全黑暗比连续光照产生更正常的胡萝卜体细胞胚成熟。另一试验胡萝卜悬浮培养体中发现光敏色素，短时间暴露在远红光，加强体细胞胚胎发生。
②培养器皿：胡萝卜愈伤组织和悬浮培养体可在各种培养器皿中生长。此外，许多环境中也曾培育成体细胞胚，如半固化和液培，许多器皿如试管和三角瓶。但培养器皿类型能影响反常胚发育频率。调节其它参数，如荷尔蒙平衡、能调整发育到某种程度。当胚培养在不同器皿中，成熟模式差异受不同通气、与培养基接触量或移动程度和可能的损伤影响还不清楚。
③气：生长在生物反应器内的胡萝卜细胞，氧浓度强烈地影响着继后胚胎发生。在临界点以下的溶解氧，有利于胚胎发生，而较高水平促进愈伤组织和根发育。这是由于低氧培养体腺苷水平增高。
④密度：Halperin(1967)报道了悬浮物中胡萝卜胚原细胞密度与胚成熟程度间有直接关系。在特定密度下，胚不能成熟。采用条件性培养基或加适宜生长调节剂如ZEA，尤其是与ABA配合或与NAA配合供原生质体再生，可增强“最低有效密度”下*的生长。如果悬浮物预处理严重地降低胚原细胞群体，如试图取得同步成熟时，密度效应很重要。
(6)发育的同步性 有二种方法使胡萝卜混合悬浮体中的胚原、非胚原游离细胞和细胞簇分开。(1)根据大小分开或分级分离，用一系列等级的不锈钢网筛或尼龙网或把细胞流经玻璃珠。(2)根据比重不同把细胞分开。首先用密度分级分离法，把细胞悬浮在10%Ficoll溶液加2%蔗糖，层积在Ficoll不连续密度梯级上(12-18%水，总体积8ml)，含有2%蔗糖，50×g离心1min，然后150×g4min。继之以速度沉降，每种Ficoll梯级是悬浮在培养基中，50×g离心30s，以除去非胚原细胞。结果群体含有许多小原胚，每个有3-10细胞。移至成熟培养基，90%以上结构形成同步胚。
Giuliano等(1983)提出另一技术。悬浮培养体通过120μm孔尼龙筛，然后经第二道50μm孔网筛。停留在第二道筛上的细胞，再悬浮在成熟培养基中。6-8天后，此时10%体细胞胚已达鱼雷期，把这种群体用170μm尼龙网过滤，装入培养皿。通过筛网的悬浮体，至少95%单胚。第一次除去的非胚原细胞悬浮体，让其下沉15-30s，然后无菌吸去大部分培养液。然后涡旋以使胚浓缩在中央，吸去外围培养基。重复进行使群体中球形原胚增多。加入新培养基后，在适宜条件下生长，2天内群体内含60%心形胚，6天含70%鱼雷形胚。每个群体可用适合大小网筛过滤富集。这种技术产生特种大小的体细胞胚。并未见抑制胚成熟和植株发育。
5．胡萝卜培养物变异 培养的植物细胞产生遗传变化已为大家所熟知，包括广谱变异，从染色体数和核型到单基因变异。这种变异叫“体细胞无性系变异”，从培养体再生株能产生相当大遗传变异性。
早已认识到胡萝卜培养的细胞，染色体数有相当大变异；多倍体性和非整倍体性和染色体形态。但是，由此再生株几乎全是二倍体，少数例外四倍体，未见细胞学反常性，至少是当时技术的结果。当时认为只有未改变染色体组成的细胞能发育成体细胞胚和植株。Mok等(1976)从不同染色体数细胞群体的胡萝卜根愈伤组织获得正常二倍体植株。Toncelli等(1985)再证实了胡萝卜胚和植株从细胞选择性地再生，带有正常二倍体染色体数，也得到非整倍体和多倍体(四倍体)。
现已知道染色体计数并非可靠指标，指出未发出遗传变化。Hemerocallis已看到体细胞胚和植株内核型变化而非组成改变。表型的和染色体正常番茄植株产生一系列突变的后代。
研究长期胡萝卜培养物的体细胞胚胎发生，胚和植株都能生长，但常是不育。培养再生株也有形态变异体，直立茎、叶分叉、叶形和叶色改变，但是后生的而不是遗传的。最近，采用特种选择步骤，胡萝卜培养的细胞和再生株都看到遗传变异体。许多情况下，从细胞培养体内已有变异分离出这些系，．即不用诱变剂。
胡萝卜培养物的第二类变化是失去再生体细胞胚能力。这发生于逐步继代期间，也发生核型变化。可追溯到非整倍体代替二倍体细胞。但这不是永久性的。驯化的橙培养物中，用除去蔗糖或组织老化可恢复胚胎发生。把胡萝卜细胞放入高浓度KIN，非胚性系变成胚性的。这是否由于促进含内生细胞分裂素不足的细胞，选择的增多悬浮的少量的胚性细胞，或就地诱导产生胚性细胞，尚待测定。加活性碳能促进胡萝卜培养体的体细胞胚胎发生，当不加生长素时，不能使之再生。
目前问题在于控制遗传和后生变异，即当需要克隆化时，能保持染色体和遗传真实性，当需要变异体时，能改变基因组。苟能注意程序，如经常建立新鲜培养物，采用适当培养基，和继代方案，在培养体和再生植株都能保持克隆的真实性。胚性培养体能长期保持。此外，胡萝卜培养体偶见基因组改变，也曾用诱变剂取得。这些能在培养中选择，以提供有用的变异体胡萝卜细胞和植株。
6．胡萝卜培养物中选择变异体 胡萝卜细胞易生长成细悬浮物，并易植板分散。细胞系长期培养保持相对稳定核型。很易掌握变异体细胞系选择。曾用许多选择方式分离出变异体细胞，产生广大范围的变异体。许多经继代保持稳定。少数研究指出从其再生株表现培养的细胞的特性。有些情况培养细胞表达特性，再生株无之。另外，这种特性似非遗传变化的结果。
分离出的变异体细胞系，包括抑制剂如氨基酸衍生物抗性，例如5-甲基色氨酸，嘌呤和嘧啶衍生物，如5-氟尿苷；和抗生素如放线菌酮。色素变异体如高水平花青素或叶黄素或叶绿素缺失。也分离出发育突变体。选择生长抑制剂抗性，如氨基酸衍生物抗性，如乙硫氨酸，5-甲基色氨酸和羟氧脯氨酸。这些有潜在实用价值，由于对一种衍生物抗性，可能取得氨基酸超产和／或高水平积存，如经选择乙硫氨酸后，游离蛋氨酸增多，经选择5-甲基色氨酸后，游离色氨酸增加，选择羟脯氨酸后，游离脯氨酸增高。针对后者选择的突变体，证实了抗性是由于吸收减少而不是超产。再生株表达这种特性，而后在培养的细胞表达。另一研究中，胡萝卜系抗抑制剂赖氨酸加苏氨酸，再生株也具抗性。愈伤组织和抗性系植株比野生型至少含有8倍游离苏氨酸，2．5倍游离异亮氨酸。
许多情况下，抗5-甲基色氨酸细胞系，积存高水平游离色氨酸，也是生长素自养的，这显然由于高水平IAA所致，后者是色氨酸前导物。但是，选择生长素自养细胞系(培养基中不需加生长素时有生长能力)，不抗5-甲基色氨酸。
也曾选择抗其它抑制剂细胞系，用于原生质体融合研究，如8-氮鸟嘌呤抗性培养体，也对HAT(氢黄嘌呤，氨喋呤，胸苷和甘氨酸)敏感和放线菌酮抗性。此外，分离出的白化细胞和植株，已证明适用于原生质体融合产物选择。
胡萝卜培养物中出现深色细胞，未能再生具高水平叶黄素或花青素植株。研究专产花青素克隆指出这不是突变基因所引起的。但是其它种能选出产花青素培养体，并保持恒定，胡萝卜悬浮培养体的色素，对培养条件确有反应。胡萝卜总有一天能取得稳定有色变异体。此外，胡萝卜变异体细胞很有希望合成次生代谢产物。
变异体系可能诱导产生增高耐逆性品种，如热、寒、旱或盐碱。虽已取得变异体细胞系，如耐寒性，但尚未导入再生植株。耐铝性确能再生抗性植株。再者这种耐性表现在这些再生植株种子产生的幼苗。
采用过滤加强程序曾选出发育突变体。其法把细胞培养成熟培养基上，正常发育成胚，取悬浮体过滤。不能生长和分化的细胞通过滤器；过滤液中富含生长和发育受阻的细胞。采用这些技术，选出了突变体细胞，或把发育停滞在特定发育时期，或完全破坏组织性发育。最有意义的是温度敏感突变体。野生型群体能在18-32℃产生体细胞胚胎发生和成熟。温度敏感突变体能在18℃发育，但高温(32℃)则不能。这是“条件性”发育突变体。正在研究温度敏感蛋白质为体细胞胚胎发生所需或相伴的。Sung与Okimoto(1981)发现二种特殊蛋白质，在胡萝卜胚开始发育时的悬浮培养体中出现。如果把胚转入导致愈伤组织形成培养基中，这些蛋白质不见了。不能进行胚胎发生的胡萝卜系也没有这些蛋白质。Pitto等(1983)分析了热冲击后胡萝卜胚性细胞合成这些蛋白质模式。期望为从新产生体细胞胚胎发生和胚性发育各个时期提供遗传标志。
诱变剂曾用许多变异体选择研究。但是只有5-甲基色氨酸抗性和放线菌酮抗性表现受诱变剂处理的培养体发生频率较高。非诱变剂处理培养体能分离出变异体，可见这种变异是自发产生的(Evans等，1984)。
7．原生质体分离和融合 Cocking(1960)发现酶法去壁可释放大量原生质体，导出了植物细胞培养新领域。Takebe等(1971)用烟草原生质体再生第一棵植株。Carlson等(1972)用原生质体融合产生第一棵种间体细胞杂种。胡萝卜不同组织分离原生质体再生成功，如根、愈伤组织、悬浮培养体和原胚性团。后者改进了再生条件，可不经愈伤组织阶段直接取得体细胞胚发育。各实验室所用分离和培养技术如表22-5。以从活跃分裂中胚原悬浮培养体或成熟中胡萝卜体细胞胚本身产生原生质体最有效。
表22-5 原生质体再生植株
胡萝卜原生质体成功地应用于产生种内、种间和属间杂种(表22-6)。Dudits等(1976)最早用PEG使悬浮体原生质体融合。再生株出现高频率四倍体，与未处理的相比。最近，突变体系的存在，利于选择融合产物。但是，Evans(1983)提出微分离措施成为另一技术，不依赖于突变体的先分离，和可能与突变体分离措施有关的遗传和后生变异。
表22-6 体细胞杂种植株
Harms等(1981)用氨基酸衍生物抗性以选择胡萝卜品系C81(抗氨乙基半胱氨酸，AEC)和品系C123(抗5-甲基色氨酸，5MT和铃兰氨酸，A2C)间融合杂种。选择抗AEC和5MT的融合产物。选得杂种植株具添加染色体，并保持衍生物抗性包括A2C，后者虽非选择培养基，抗放线菌酮(CH)细胞系用于同样方式。CH抗性是隐性-结果杂种不表现CH抗性。融合后一年植板细胞中有10-4确实重现。
最近选出的抗8-氮鸟嘌呤AZGR15系，表现出对培养基中的次黄嘌呤、氨喋呤、胸苷和甘氨酸(HAT)敏感。这是由于抗性细胞中HPRT活性改变所致(次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶，HPRT)。以后从AZGR15细胞中选得鹅膏蕈碱抗性细胞，它带有一个隐性特性(HAT敏感性)和一个显性(鹅膏蕈碱抗性)，用作与野生胡萝卜细胞原生质体融合试验的“万能杂交者”，这种融合杂种，能用含HAT培养基(野生型特性)和含鹅膏蕈碱培养基(抗性系特性)生长。
用核白化胡萝卜突变体与D．capillifolius原生质体融合取得异种杂首次成功。体细胞杂种的鉴别，采用了把融合产物生长于培养基上，这种培养基有利于白化亲本再生和抑制绿色亲本再生。再生的全部绿色组织和植株是想像的体细胞杂种。再生植株具有中间叶形态、白色根，近乎添加染色体数。杂种间授粉产生种子的后代，出现白化性和叶形分离。
不能再生植株的抗5MT和A2C胡萝卜悬浮培养物原生质体与能再生的D．capillifolius原生质体融合。选择抗5MT、绿色克隆能以形成芽的，只有融合的原生质体才能得到。这些芽具有中间叶形，添加染色体和杂种同工酶谱。这些植株的培养体表现中抗5MT和完全抗A2C。杂种细胞的质粒DNA与胡萝卜的相似，但mtDNA与二亲都不同，指出发生了重组。
曾产生了一些异属杂种。核白化胡萝卜原生质体与不分裂的羊角芹(2n=42)叶肉原生质体融合。取得的绿株表现羊角芹根形态和根叶黄素。但只测出胡萝卜染色体。白化胡萝卜原生质体与芹(Petroselinum hortense 2n=22)叶肉原生质体融合。染色体数最多再生株2n=19，指出芹染色体除一条外全部丢失。通过白化性状的校正和芹同工酶谱带特点，可见一些芹遗传信息转给了胡萝卜。
用胡萝卜原生质体进行了远缘杂交。有些看到细胞分裂。Dudits等(1976)报道了胡萝卜原生质体与大麦的融合，Reinert等(1976)胡萝卜与矮牵牛原生质体融合，前者红色(花青素)，矮牵牛含绿色叶绿体。2天内形成细胞壁，20%异核体发生分裂。再生了植株。
目前，胡萝卜远缘杂交用于观察染色体丢失。Sala等(1985)融合胡萝卜与水稻原生质体，以研究它们对杂色核基因组的贡献。Dot杂交分析指出杂种是不对称的。大部分核基因组与胡萝卜亲本是同质的。水稻只提供少部分，但包括了选择的抗性基因。
胡萝卜原生质体也用于研究细胞器和DNA吸收，包括叶绿体渗入。此外，有许多DNA渗入研究，特别是通过脂质体媒介。
8．单倍体植株 当草粒种子产生二株幼苗(双生幼苗)时，产生了单倍体，但频率很低，估计双生频率为2．6×10-3，有一个研究单倍体为1／600。其中只有一株产生的细胞是单倍体细胞系。胡萝卜单倍体极有价值，作为突变体选择的细胞源，由于任何突变得以表达，显性或隐性。染色体加倍后，可得同质体，是把突变基因掺入育种方案的资财。
高度纯系、旺势系加倍单倍体可用于生产杂种种子，由于自交严重衰退，很少得到。花药和、或小孢子培养为产生单倍体提供可能性，加倍后，可望得到同质的和自交可育植株。花药培养直至1984年Anderson首次成功。取大田生长的胡萝卜植株除去轴芽，只让形成一个伞形花序。取伞形花序放在7℃下2天，用镊子取花药，接种在琼脂培养基上。每第二周取未污染花药各个地转移到新鲜培养基上，建成无菌培养体后，移放在薄纸片上，以供转移。几个月后，产生了愈伤组织和胚。其频率为0．8%(培养了20000个花药结果)。其中61%再生植株(总成功率的0．5%)。二个商品栽培品种的100个花药产生的克隆，其中50个产生的植株移栽成活(土中)、春化，产生自交种子。42个克隆染色体计数结果：14单倍体，25二倍体，和3单、二倍体嵌合体。未发现多倍体。
9．无性系繁殖 胡萝卜植株任何部分和任何发育时期，成功地产生细胞培养物和体细胞胚(Ammirato，1983)。常忽视了基因型间的差异。Steward等(1974)发现胡萝卜4个栽培品种体细胞胚生长在数量上和形式上都有差异。
胡萝卜悬浮培养物可在小容积培养基中生长大量体细胞胚。平均每毫升近于50-60胚。可见每升常可达60000胚。种子产生的自由授粉品种内有变异性，悬浮培养体为产生大量遗传性一致植株提供有力方法，足供商品生产利用。
关键问题在于细胞培养和胚和植株发育期间能否保持染色体和遗传真实性。显然，经常启动新培养体和注意继代规划，能以有效地降低培养体中染色体反常性和损失胚原竞存力。群体内一致性或变异性的标志是异质酶同工酶分析。比较细胞培养产生的胡萝卜植株与种子产生材料的异质酶磷酸葡萄糖异构酶PG1指出，指定栽培品种一份种子中单粒种子产生值株间有差异性。有二类亲本。同质个体表现出慢移动型(大量的)或快移动型。由于这种酶是二聚体，异质体表现三条带，二亲本型是异质二聚体所有含有同样快移动型的异质酶，与取外植体的亲本相同。这种结果首次提供论据，胡萝卜植株可能在克隆繁殖期间保留它的遗传真实性。体细胞胚产生的芹菜植株的相似同工酶分析，表现高频率正常表型(Orton，1985)。
(1)大规模繁殖 生物反应器已用于大规模生长植物细胞，包括胡萝卜细胞研究。由于胡萝卜细胞和体细胞胚易于生长于液培并能取得大量细胞，为大规模繁殖提供潜势。与常规容器如振荡三角瓶相比，生物反应器有许多优点。能提供大的工作容积，最小的至少可装一升培养液。此外大多数生物反应器内装有搅动设施，机械的或气动，近乎保持同质培养体。连续培养时，培养基可按时更换，能精确控制生长和成熟。但搅动器能毁损细胞(切割)，气动设施限制通气速率。最简单设计排除废培养液不洗出细胞。一些复杂设计能分出细胞，常用离心法把细胞排出培养液，然后把它们放回培养基。
最近，回旋过滤生物反应器用于生长胡萝卜悬浮培养体和体细胞胚。此器像普通搅动库，除中心回转轴装有一室作为过滤器。过滤室与搅动板相偶合，供连续搅动。由于无叶板，因此搅动培养体不致切割细胞。通过过滤器能排出培养液。适当选用过滤器可不把细胞洗出。控制培养液经回旋过滤器排出，和培养液和细胞从出口排除，能分别调节培养液和细胞流动。经沥水器回管通气。使搅动培养液和通气独立进行。回旋过滤反应器有多种型式。最简单的由单个单元组成，从细胞增殖到胚成熟在一个生物反应器中完成。最复杂的包括多级系统，发育中胚能从一个生物反物器流入另一个。胚结构与常规容器内生长的相似，转变成株数相等。
(2)运送体系 胡萝卜体细胞胚可直接放入幼苗盘内，或用液淋技术转移。或把它放在保护营养箱中。好像种子卷带一样分个体包裹。Redenbaugh等(1984)首次报道紫苜蓿和芹体细胞胚的包裹，Lutz等(1985)首次采用于胡萝卜。前一研究，把体细胞胚与3．2%(w／v)BDH藻酸钠混合，单个地掷入50mMCaCl2溶液。胚周围形成藻酸钠壳，在溶液中培养1小时期间形成硬化的0．5-1．0g／朔果。当放在1／2SH培养基上，30-40%紫苜蓿包裹的体细胞胚和90-100%芹菜体细胞胚长成植株。胚转成株也能在
石、沙或泥炭填充物中产生，频率较低。用1／2SH浇，湿度保持100%。后一研究，从培养在B5+0．45μM2，4-D的悬浮培养体通过94μm网孔的细胞再悬浮在MS不加荷尔蒙的母液取得胡萝卜体细胞胚。7天后，以含1μMABA培养基代换之，胚再生长7天。细胞群体通过Percoll梯级离心(12．5／25／50%)，在25／50界面上收获，再经第二次离心(25／35／45%)，在25／35和35／45界面上收获。结果所得群体通过520μm筛，胚存留在筛上，移至运送体系生长。包裹措施无加详述。
上述二种体系中，胚小到足以适于包裹，只有在加外源碳的培养基上能进一步发育。需要研究改进成熟体细胞胚质量，改变包裹环境，使之更接近于固有胚乳状态，围绕着成熟合子胚。
(二)培养程序
1．体细胞胚胎发生 胡萝卜体悬浮培养体中的细胞胚胎发生和再生植株程序是标准的(Ammirato，1983)。
(1)取0．5-1cm叶柄或0．5cm3储藏根接种在MS琼脂培养基上，加4．5μM2，4-D，采用无菌技术。
(2)光或暗培4周后，应用足量愈伤组织。
(3)取2-3g愈伤组织继代，用50mlMS培养液加4．5μM2，4-D，装入250ml欧氏三角瓶或培养瓶。欧氏三角瓶放在旋转振荡器上，保持25℃，125-160rpm；培养瓶旋转架上，旋转1rpm。光、暗均可。
(4)取培养14-18天的细胞继代(欧氏三角瓶的)，培养瓶的则用21-28天的。增殖快的培养体可缩短继代间隔天数。
(5)从第4步起无菌通气或缓慢地移去废培养液，再悬浮在不加2，4-D培养基上，以启动胚发育。
(6)为了取得更一致的胚群体，将原胚悬浮体通过一系列不锈钢筋，从220μM网孔开始，逐步减小。胡萝卜用74μM网孔可得相当密集的单细胞和小簇。43μM网孔产生极细悬浮体或单原胚，但密度低。
(7)将洗过的和筛过的悬浮体移入50m1MS，装在250ml欧氏三角瓶，或10ml培养基装在培养瓶中。如果群体密度低，培养基中可加0．05-0．5μMZEA。为了取得更正常发育的胚和抑制过早发育，尤其是根伸长，在接种时可加0．1-1μMABA。ABA在室温下可溶于蒸馏水，暗中进行，经过滤后，加入高压蒸气消毒的和冷却培养基。
(8)为了更正常发育，培养体应在完全黑暗中生长。约经8天可见胚，10-15天达到成熟大小。
(9)体细胞胚植板在不加2，4-D的琼脂培养基上，以发育成再生植株。可用其它支撑物，如滤纸桥或纸塞，利于更换培养基和其除去，以供移植。
(10)再生植株移入Jiffy钵或
石，以备继续发育。
2．原生质体分离、培养和再生
(1)用无菌60×15mm培养皿，加入2．0ml快速生长中悬浮体(2日龄)与2．0ml下列酶混合液：OnozukaR-10(2%)或Cellulysin(2%)加果胶酶(1%)，Driselase(0．5%)和Rhozyme(0．5%)溶于山梨醇(0．35M)，甘露糖醇(0．35M)，2-(N-mo-rpholino)ethane-sulfonic acid(MES)(3mM)，CaCl2·2H2O(6mM)和NaH2PO4· H2O(0．7mM)pH5．6。
(2)暗培，振荡(30-50rpm)5h。此时制品中仍有一些未消化细胞。
(3)将原生质体-酶混合体过不锈钢筛4．4μm网孔，以分开原生质体与未消化细胞。
(4)离心40×g4min洗去原生质体上的酶。用无菌锥形试管。
(5)融合与吸取试验：用无菌巴氏吸移管除去上清液。轻轻把原生质体再悬浮在10ml洗液中，含有0．4M葡萄糖，3mM CaCl2·2H2O和0．7mM NaH2PO4，pH5．6。
(6)反复离心，把原生质体再悬浮在洗液中。
(7)培养原生质体：用无菌巴氏吸移管吸去上清液。用8 ml8P培养液再悬浮原生质体沉降物，反复离心和除去上清液操作。
(8)愈伤组织再生，把洗过的原生质体再悬浮在2 ml8P或基础培养基中，单加0．4M葡萄糖或2．3μM 2，4-D+1μM NAA+0．5μM ZEA，pH5．6。原生质体直接长成体细胞胚，用1μM NAA+0．5μM ZEA。
(9)把再悬浮的原生质体接种在60×15mm无菌培养皿的小滴中。用双层石蜡膜封边，以免原生质体污染和脱水。放在扩散光下。
(10)2-5天内应发生原生质体第一次分裂。
(11)每隔1-2周，滴上加新鲜培养基，直到可见快速增殖中愈伤组织或形成体细胞胚。
(12)把细胞转入不加荷尔蒙的基础培养基中，从愈伤组织产生体细胞胚发育。后者转入新鲜无荷尔蒙培养基，开始再生植株发育。培养管中加棉花，使易于更换培养基而不伤根。
(13)除去培养基后，把再生植株移植于泥炭上，保持高湿度，继续生长。
(14)逐步降低湿度，增加光强，然后移至温室。
3．促进开花和结实 胡萝卜是二年生作物，需经低温处理，春化，才能在翌春开花。培养体再生株，移栽田间过冬，下季开花。温室生长植株或用大田主根移栽的，可用下述步骤冷处理。培养的细胞再生植株，对低温需要常有缩短。间或有不需处理当季开花的。
(1)选成熟胡萝卜植株，尤以主根良好的，使之生长于大钵内，有助主根生长。
(2)除去其芽，在根尖2-3cm处切断。
(3)将植株倒出，除去主根上的土。将根放入杀菌剂溶液中。Captan最好，把商标说明决定浓度。
(4)轻轻充分地洗去根上的土，并除去侧根。
(5)让根干燥。用纸吸干。贮藏期间主根有腐烂倾向，所以必需是干的。
(6)把根放入装有等量木屑袋。每袋1或少数根。将纸袋放入塑料袋，除去空气、密封。
(7)处理的装袋的根放在5-8℃8-10周。春化时期视材料而定。可定期取根，观察其能否生长和开花。
(8)贮藏期间，定期检查袋是否有水滴。一旦发现，可在袋上穿孔或移放新、干袋。
(9)经适当时间后，去袋取根测验。去腐烂的。
(10)根种在钵里，第一周放在较冷温室里(15-18℃)。然后移至较暖环境(18-21℃)，开花发育。
(11)当伞形花序出现时，花将顺序开放，每朵花内，花药最先成熟。用纱布袋套伞形花序，内放蝇咀，使之有效授粉。同袋套装不同开花时期花序，授粉和结实更好。也可用蝇成虫，但更难于掌握。
(12)随着种子成熟，色转棕，伞形花序向上弯曲。4-6周内干燥前收集种子。如果认其成熟，种子将散落。
(三)展望
胡萝卜是培养产生体细胞胚胎发生的第一种植物，已成为基础研究的经典系统。开发或很快采用其它植物的许多人工培养技术，对了解基本机理如形态建成，突变体选择、体细胞杂交和异属与异种杂交的基因活动取得很大进展。但尚未曾应用于改进商品胡萝卜品种。
由于胡萝卜种子发育不规则和缺乏遗传一致性，利用胡萝卜细胞和体细胞胚能大量产生的特性，为大规模克隆繁殖提供着潜力。克隆化产生的一致性植株，可用于温室或大田种植。单株新奇变异能在用于育种方案前进行繁殖。繁殖有用的雄性不育，为生产杂交种子提供足量植株。
大规模繁殖所需先决条件是：(1)足量生产胡萝卜细胞和体细胞胚，(2)控制成熟模式，提供能生长或高频率转变成植株的胚，(3)克隆植株保留高度遗传真实性，和(4)开发适合的运送系统，包括机械化。群体遗传变异应保持在自然群体中发生的变异正常水平之下。
从细胞增殖转入有组织生长需要调整培养基和细胞密度。用于大规模繁殖的生物反应器，应能有效地更换培养基，又能控制细胞和胚密度。回旋过滤生物反应器对此更有希望的设计。开发适合运送系统和掌握体细胞胚尚待提高。
花药培养产生单倍体有许多潜势。(1)染色体能加倍，一步取得真正同质性。也能作为原生质体源，用于融合试验。二种单倍体细胞融合，将能重建正常二倍体组成，应是营养和生殖正常的。这就可以组合核编码特性，而不增加染色体组成。Anderson(1984)取得花药培养成功。并已取得大量有关信息供胡萝卜小孢子和花药培养利用。深入发展和应用单倍体，可为胡萝卜育种和作物改良提供巨大潜势。
原生质体融合有可能取得广谱核-质组合，和细胞质转移而无核杂交，能采用适合选择技术做到。使一个群体原生质体的核钝化，产生细胞质杂种。还有小片遗传信息如质体、线粒体或DNA，经脂质体媒介，微注射或其它技术提供着巨大可能性。最后，不仅可增加变异性，也能再生迄今为常规育种法所不能产生的杂种。
突变体的应用，可直接选择有用特性如抗病性，抗除莠剂性，耐寒或耐盐。也易于选出优良植株和主根特性，如味好、色、质地、形状、产量等。
这种技术可使胡萝卜改良取得巨大成就。但需将研究目标导向解决农艺问题，并与常规育种规划相结合。
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