棉花
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第715页（14454字）
棉花属于锦葵科(Malvaceae)棉属(Gossypium L．)，棉属包括39个种，其中6个种是四倍体(2n=52)，其余33种是二倍体(2n=26)，分布于非洲，中、南美洲，大洋洲，分属于六个基因组群：A、B、C、D、E、F。四倍体棉种是双二倍体，基因组为AD。四种栽培种，其中二种二倍体，二种四倍体。二倍体种分属于A和B基因组。四倍体栽培种陆地棉(G．hirsutum)栽培分布于全世界产棉区，热带干旱灌溉棉区种植另一种四倍体栽培种海岛棉(G．barbadense)。当前育种目标，着重于纤维品质改良，矮杆、早熟，有限开花习性、多抗性和无毒棉，以利棉产品的综合利用。
(一)研究进展
棉花各棉种一栽培种和野生种和种间杂种已报道了六类组织培养：即愈伤组织、胚珠-胚，茎尖、花药和原生质体培养，以及体细胞胚胎发生。这些研究的目标不同。愈伤组织培养旨在启动细胞悬浮培养体；原生质体分离和融合，继而再生植株，以形成体细胞杂种；胚珠培养试图取得棉纤维发育的基础信息，较好地了解进而控制纤维产量和品质；胚培养用于研究胚拯救技术，以利于在正常条件下败育的胚取得杂种；茎尖培养以利于产生大量同质再生植株，供珍贵材料和杂种的繁殖和体细胞遗传研究；花药培养用以针对育种目标和诱变研究产生单倍体和、或双单倍体，一举而取得纯合个体，以缩短育种年限，和产生更高的杂种优势，以利于杂交棉花的生产发展。
本文将就每类组织培养技术分析，以揭示其在棉花育种和生产中的潜在应用价值。
1．愈伤组织培养 表27-1列举曾启动愈伤组织的棉种。Beasley(1971)首次报道从陆地棉的珠柄外植体或培养的胚珠珠孔区域启动愈伤组织。从而开展了生长调节剂对受精的和未受精胚珠培养的生理作用研究。Hsu和Stewart(1976)在研究胚珠生长和发育中，从陆地棉胚珠珠孔区域产生的松散愈伤组织里。由于2-氯乙烯磷酸(CEPA)向培养基放出的乙烯，刺激培养中愈伤组织生长和扩展。进一步研究CEPA+GA3大大地促进愈伤组织生长。
表27-1 棉属种的愈伤组织培养
Schenk和Hildebrandt(1972)从陆地棉中胚轴外植体成功地建立了松散愈伤组织培养物。Davis等(1974)用叶外植体愈伤组织产生了悬浮培养物。Rani和Bhojwani(1976)从陆地棉和树棉取得生长慢松散愈伤组织。
Katterman等(1976)用强抗氧化剂二硫苏糖醇(DTT)和高浓度NAA培养海岛棉子叶启动紧密愈伤组织。另一抗氧化剂抗坏血酸或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)对阻制多酚氧化效果不大。愈伤组织继代，包括改变碳水化合物用葡萄糖代替蔗糖和不加DTT。观察到继代愈伤组织生根，也再生植株一株。
Smith等(1977)用规定条件启动和继代G．arboreum下胚轴产生愈伤组织，葡萄糖、高光强和高温相配合，结果愈伤组织生长最适，无褐化。取得了再生植株。
表27-2 棉花花药培养基SJ-1
Price等(1977)和Price与Smith(1977)(表27-3)用5个种启动和继代愈伤组织，以葡萄糖为碳源和高光强，愈伤组织继代要求不同浓度的不同生长调节剂。由于葡萄糖和高光强，培养基褐化或变色受到抑制。
表27-3 棉属种愈伤组织诱导培养基
愈伤组织诱导，褐化和继代中的困难，棉属业已克服。采用葡萄糖，高光强和29-30℃培养条件，可避免酚的氧化。从愈伤组织再生植株取得初步成功。上述再生植株例证，可能是从子叶组织直接产生的。但是Price与Smith(1979)从克劳次基棉下胚轴取得体细胞胚胎发生。Davidonis与Hamilton(1983)培养陆地棉下胚轴切段，经继代二年以上的愈伤组织获得胚状体和再生植株。刘桂云(1983)用G．davidsonii，叶片为外植体观察到胚状体。刘桂云等(1986)以雷蒙德氏棉，G．davidsonii和中棉的幼叶培养，G．davidsonii培养体经愈伤组织→胚状体→再生不完全植株。雷蒙德氏棉偶见幼芽；草棉(G．herbaceum)出叶；比克氏棉(G．bickii)形成大量根，不易取得胚状体。王月芳、奚元龄(1986)用陆地棉栽培品种荆436主茎茎尖培养再生植株，并在再生植株茎基部产生愈伤组织，连续产生植株和不定芽，显示了可能产生大量无性系的新景象。
Mitten(1985)培养陆地棉胚轴取得再生植株成功。提出棉属组织培养对已熟知的生长素一细胞分裂素互作反应不同，生长素对球形胚增殖无效，而细胞分裂素以2ip为优，为唯一关键因子。首先在愈伤组织培养体鉴别出胚形成(胚性)愈伤组织，常需经过长时期多次继代后才能启动发育，必须从周围的非胚形成愈伤组织(衰退的，深色)中把胚形成愈伤组织(白色)分开。其次进行选择性继代，使胚保持在发育早期。在长期继代中，球形胚解组织化增殖许多小细胞团，转而发育成更多球形胚，这种循环的不断发展，是培养体系的关键部分。延长培养球形胚进一步发育产生心形胚和鱼雷形胚，发芽成株。
Davidonis等(1983)用加与不加生长素循环培养陆地愈伤组织，以增殖胚形成愈伤组织类型。植物遗传公司学者认为生长素浓度无关重要。但一旦出现胚形成愈伤组织，要加少量细胞分裂素以保持之。Rangan等(1984)报道陆地棉悬浮培养体增殖体细胞胚胎发生。Mitten等(1984)，Rangen等(1984)，王月芳、奚元龄(1986)曾取得许多再生植株。Anderson，正在研究体细胞无性系变异，Altman研究这些再生植株的细胞遗传学。Davidonis(1983)和刘桂云等(1986)取得了不完整植株(无根)。经验指出再生植株技术改进，主要在于改进胚质量(生产胚性细胞)。应予继续努力。
2．胚珠-胚培养 棉花胚珠离体培养有二个目的。(1)为纤维发育生理学提供有价值信息；(2)取得异种间杂种。许多情况下，活体杂种败育，由于胚乳与胚不亲和，或胚乳发育破坏。Weaver(1957)观察到陆地棉×海岛棉异种杂交败育。Lofland(1950)取开花后20-27天棉胚离体培养，但是开花后15前的离体胚不能继续发育。Dure与Jensen(1957)用IAA和GA3处理重37mg胚细胞不能分裂或伸长。
取授粉后20天的海岛棉×陆地棉杂种胚，Weaver(1958)培养成功，直到成熟。Mauney等(1967)取12-14日龄幼胚培养(心形期)在Mauney培养基(表27-4)，有75%以上生存。培养体生长在30℃，连续光照100呎烛光。胚的快速生长和加强存活率，要在培养基加4mg／l苹果酸铵或钙。分析12-14天龄胚珠胚乳液(活体)，指出其内生苹果酸浓度超过7mg／l。Eid等(1973)培养陆地棉受精胚珠在不加生长调节剂的MS培养基。开花后5-10天胚珠培养体取得正常幼苗。
表27-4 棉心形胚培养培养基(mM)
(Mauney等，1976)
人工培养棉胚珠的有价值信息，应用于胚珠-胚培养取得异种杂种。Steward与Hsu(1977)30±2℃液体培养基暗培取得发芽(表27-5)，发芽后把胚珠转移到第二培养基(表27-6)，30℃，16h光照，光强58μEm－2s－1，取得了芽和根平衡生长的胚。
表27-5 陆地棉Hancook胚珠*培养发育成熟胚培养基(mM)
(Steward与Hsu，1977)
表27-6 离体培养中胚根和芽平衡生长培养基(mM)
(Steward与Hsu，1977)
沈曾佑、颜季琼等(1978)报道用陆地棉苏棉3号的受精胚珠培养中剥离胚，培养在加2mg／lKIN的改进Beasley培养基(用原浓度的1／5-1／2)，用0．6%琼脂固化，有利子叶转绿和正常生长，然后转移到Radin(1975)或Kasperbauer(1972)培养基，诱导生根，再生幼苗成功。用有下胚轴的无子叶幼胚，在适宜条件下，也能诱导成苗。还指出NH4+并非诱导幼胚成苗的决定因子，但可促进生长。
牛永章等(1985)采用棉属种间杂交，幼胚离体培养和染色体加倍等，取得了陆地棉×海岛棉种间杂种。与常规杂交育种方案相结合，培育成郑州系列新品种。梁正兰等(1978，1982)、韦贞国(1978)、钱思颖等(1981，1982)、张圣章(1982)、李炳林等(1981，1982)、何六奇等(1982)、刘承智等(1982)、胡绍安等(1982)采用幼胚培养，取得多棉种间的杂种，为遗传研究和培育新品种，和野生棉有益基因〔如纤维强度、细度；棉毒素(腺体)特性〕的转入栽培品种提供丰富种质资源。
3．茎尖培养 Chappell与Mauney(1976)启动茎尖培养，测验陆地棉茎尖分生组织正常生长和发育营养要求，未获成功，但确已观察到新叶原基启动。未能生根。简单盐类培养基加1．4-2．9μM GA3，似能促进生长，但CW、生长素和维生素对分生组织发育无效。奚元龄(1978)(未发表)用陆地棉栽培品种茎尖培养在正生长中的愈伤组织块表面上，观察到确能生长，但未见生根。王月芳、奚元龄(1986)培养陆地棉到436茎尖在MS培养基，附加IAA 2mg／l，KIN 1．0mg／l，肌醇100mg／l，取得完全植株。继续继代培养，在其茎基部出现胚性愈伤组织和不定芽，经分开培养，能不断产生新苗。为棉花一茎增殖大量无性苗开辟了途径，创造了棉体细胞遗传研究的先决前提。正在进一步研究中。
陆地棉TM-1成株腋芽培养，产生芽频率为20-40%。培养基MS盐类，1．2μM盐酸硫胺素，4．6μM KIN，5．7μM IAA，83mM葡萄糖和活性碳。用相同培养基加11μM NAA继代培养芽，取得低频率生根。正在进行增高芽和根发育频率研究。
4．花药培养 Barrow等(1978)报道海岛棉和陆地棉花药培养体，取得单倍体和二倍体混合愈伤组织。由此启动的液基培养体，有二倍体染色体组分。诱导愈伤组织的培养基汇综列如表27-1。二次培养基中以葡萄糖代替蔗糖。当光强从56增强到150μEm－2s－1时，愈伤组织分化生根。奚元龄等(1978)报道用陆地棉DPL花药小孢子发育单核中和后期培养在SJ-1培养茎，附加2，4-D 0．5mg／l和增高NAA浓度2-3mg／l，0．5mg／l IAA，2mg／l KIN，诱导愈伤组织效果较好，平均频率12．37%(4．44-21．3%)。GA 0．5-1．0mg／l有所增益。愈伤组织继代培养后，经长期多次继代，在过程中，曾观察到根(常见)、叶、茎、和绿色原胚和胚状体，并有继续发育现象。经用培养中花药石蜡切片观察，曾出现小孢子在花药内开始第一、二次有丝分裂，形成多核和多细胞状态。
5．体细胞胚胎发生 Price等(1979)报道克劳次基棉悬浮培养(加谷酰胺10-15mM)3-4周后，观察到体细胞胚胎发生。只有把愈伤组织预培养在含有49μM 2ip培养基后，才出现胚胎发生。门冬酰胺对促进胚发育效果，比谷酰胺低得多。培养基加2，4-D，悬浮培养体旺势增高，继之形成大量胚。未能取得完整植株。
6．原生质体 Bhujwani等(1977)从下胚轴产生的愈伤组织分离出陆地棉原生质体。酶溶液是4%Meicelase，0．25%Driselase，0．4%Macerozyme，11%甘露糖醇和无机盐类，pH5．6。暗培3h，31℃。18天以上愈伤组织不能有生存力原生质体；但是，6-9天龄的可得15%原生质体。原生质体暗培，27-29℃，B5盐类和维生素，加0．55mM肌醇，27．7mM葡萄糖，29．2mM蔗糖，0．6M甘露糖醇，2．3μM 2，4-D，1．1μM NAA和0．9μM BA，pH5．6。加3．12mM NH4NO3和5．31mM CaCl2加强生存率。光培会导致出芽，温度低于25℃，未观察到分裂。只有1．5%原生质体分裂形成细胞团。5周时，可看到25-30细胞的细胞团。
Khasanov和Butenko(1979)用陆地棉10-12日龄幼苗子叶组织分离原生质体，用1．5%纤维素酶，0．5%果胶酶和0．5M甘露糖醇，培养在18-21℃，16-18h，原生质体产量为68．5%。原生质体植板在MS+2．3μM KIN，4．5μM 2，4-D，蔗糖、葡萄糖和16．7mM半乳糖。半乳糖是形成细胞壁所必需。培养后3天可见再生壁。愈伤组织未见再生植株。
Finer与Smith(1982)用克劳次基棉下胚轴产生的愈伤组织分离和培养原生质体。酶溶液含有1%Cellulysin，0．5%Macerase，和0．7M甘露糖醇，pH4．7。暗培，轻振荡(40rpm)14h。洗后，原生质体悬浮在MS+0．55mM肌醇，1．2μM盐酸硫胺素，83．1mM葡萄糖，0．6M甘露糖醇，和3g／l琼脂，pH5．7。暗培4天后，移入低光50μEm－2s－1，16∶8光周期，29℃。2周内形成成块愈伤组织。
佘建明等(未发表)用海岛棉下胚轴愈伤组织分离和培养原生质体，观察到细胞壁再生和细胞分裂，形成愈伤组织，正在进行诱导分化中。
Firoozabady等(1986)从陆地棉和海岛棉10-12日龄幼苗子叶和3周龄幼叶叶肉分离原生质体。酶溶液含有1%Cellulysin，0．5%Macenase，MS盐类，UM维生素，400mg／l肌醇，0．5mg／l 2，4-D，1．0mg／l NAA，0．25mg／l BAP，0．25mg／l KIN，7%w／v甘露糖醇，2%W／v葡萄糖，10mM CaCl2，pH5．7，暗培，振荡50rpm，30℃，17h。纯化原生质体培养在改进MS加5mM NH4NO3，3mM CaCl2，50μM H3BO3和30μM ZnSO4，加UM维生素和400mg／l肌醇，7%甘露糖醇，2%葡萄糖，0．3%半乳糖，0．2mg／l各BAP和KIN，0．5mg／l2，4-D，1mg／l NAA，1mg／l ZEA，和1mM谷酰胺，pH5．7。暗培，30℃。用荧光增白剂观察再生壁。用荧光素双醋酸染色测定原生质体成活率。原生质体产量为2．5×106原生质体每克鲜重，成活率70%。陆地棉原生质体培养后3-4天，50-80%再生细胞壁，4-5天显现第一次分裂，2周内出现第二、三次分裂，最适植板密度陆地棉为4-6×104原生质体／ml，海岛棉为2．5×104。海岛棉原生质体培养后4-5天，75-80%再生细胞壁，20-25%进行第一次分裂，2周内形成5-8细胞克隆。进一步分裂均未成功。影响原生质体和成活率因子有：基因型、年龄，组织和供体植株生长条件，酶混合物和浓度，预质壁分离时期，培养时期，和培养基。10mM腐胺，0．5mg／l GA3或1mg／l pCPA加入MSm，有时能增长保持原生质体活力时间。陆地棉子叶原生质体细胞分裂以生长调节剂如下组合为好：(mg／l)BAP 0．2-2，KIN0．02-2，ZEA 0．1-2，NAA 0．3-15，2，4-D 0．2-7。高水平微量和大元素的培养基，可取得细胞分裂百分率高。El-Shihy等(1983)也指出MS+大元素和微量元素，可大大促进再生细胞壁和细胞分裂。可见这些盐类和荷尔蒙的平衡，是棉原生质体细胞分裂所需。
El-Shihy等(1983)研究海岛棉Giza70子叶原生质体分离和培养，结果指出酶配比、浓度是分离棉子叶原生质体的关键因素；植株年龄，甘露糖醇浓度，保温时间，都有密切关系。影响原生质体再生壁和细胞分裂的因素是渗透压，葡萄糖用量，原生质体密度，温度。适当提高大元素和微量元素，能加以促进。生长素与细胞分裂素平衡，有利于细胞分裂。El-Shihy等(1986)继续上述研究，取得再生植株成功。认为原生质体分离经少数几次分裂后，要用新鲜培养基稀释培养体，达到适当成分，克隆才能继续发育。然后把愈伤组织克隆转移到琼脂培养基，经连续继代约一年，有许多愈伤组织开始生芽，有些可能通过体细胞胚胎发生产生的。即使在未改变培养基或条件下，产生了器官发生，继而取得再生植株，生长成熟。
综观上述研究结果，棉花组织培养取得巨大进展，无论叶、下胚轴、子叶、茎尖未成熟胚珠、胚培养，无论栽培种海岛棉、陆地棉等或野生种克劳次基棉G．davidsonii等，都成功地再生植株。陆地棉下胚轴原生质体培养也再生植株。结果指出棉花愈伤组织诱导和培养较易成功，并能经常在愈伤组织产生毛根和胚性细胞团或颗粒，但诱导再生植株，尚待努力。
(二)培养程序
愈伤组织诱导和继代，胚珠-胚培养、体细胞胚胎发生和原生原体分离已取得良好效果的程序分述于下。
1．愈伤组织
(1)用1%次氯酸钠加一滴吐温20／100ml表面消毒去壳棉籽，淋浇，浸入95%乙醇，火焰消毒。
(2)将种子放入无菌蛭石，用蒸馏水浇湿，发芽。
(3)经5-14天，依基因型而定，切取下胚轴，剖开，接种在琼脂，切口表面向下。诱导愈伤组织培养基如表27-3。培养条件29±2℃，130μEm－2s－1，15∶9光周期。
(4)生长1-2个月后，愈伤组织继代。继代培养基视基因型而定。表27-1指出各个种的继代培养用的生长调节剂变化。
2．胚珠-胚培养 Mauney等(1967)用下列程序培养心形期胚直到成熟。
(1)授粉后12-14天收获棉铃。
(2)表面消毒。
(3)用无菌解剖针和刀片切取胚。心形期胚约长0．2-0．3mm。
(4)培养基见表27-4。30℃，连续100叹烛光冷白荧光。
3．胚珠胚培养和幼苗发育程序(Stewad和Hsu 1977)。
(1)授粉后2天收获棉铃。
(2)浸入乙醇表面消毒和火焰消毒。
(3)取胚珠，漂浮在培养基上。暗培，30±2℃，约10周。
(4)胚珠继代在琼脂固化培养基，30℃，16h光周期，光强约58μEm－2s－1。取得根和芽平衡生长的有生活力植株。
4．体细胞胚胎发生(Price和Smith 1979；Finer等，1983)
(1)用无菌发芽的种子启动愈伤组织培养体，培养在MS盐类，1．1μM盐酸硫胺素，0．055mM肌醇，0．088M葡萄糖，11μM IAA，4．6μM KIN，pH5．7，0．6%琼脂，29±1℃，16h光周期，130μEm－2s－1。为了增高胚产量，把取得的无性胚培养在相同培养基(见步骤2)，以启动愈伤组织。
(2)愈伤组织生长4-7周，每隔二月继代在上述培养基，用5．4μM NAA和49．0μM 2ip代替IAA和KIN。光强降低到30μEm－2s－1。
(3)继代2周后，取愈伤组织2-3g，启动悬浮培养体，用50ml液体培养基B5盐类和维生素，15mM谷酰胺，0．45μM 2，4-D，0．058M蔗糖，pH5．7，150rpm，16h光周期，60μEm－2s－1。
(4)2周后，取培养体过滤，用6-8层纱布，取留在纱布上的细胞团再悬浮在新鲜不加2，4-D的悬浮培养液中。
(5)3-4周后，可见体细胞胚。
5．愈伤组织原生质体分离
(1)用无菌发芽种子下胚轴切段启动愈伤组织培养体，培养在MS盐类，1．1μM盐酸硫胺素，0．55mM肌醇，0．088M葡萄糖，11μM IAA，4．6μM KIN，pH5．7，0．6%琼脂，29±1℃，16h光周期，30μEm－2s－1。
(2)愈伤组织生长4-7周。愈伤组织继代在上述培养基上，用5．7μM NAA和49．0μM2ip代替IAA和KIN。
(3)用继代后2周的用愈伤组织，放入酶溶液分离原生质体，酶溶液含1%Cellulysin，0．5%macerase，0．7M甘露糖醇，pH4．7，40rpm，暗培14h。
(4)离心100×g洗原生质体3次，每次5min。每次离心后，除去上清液。
(5)取约104-105原生质体悬浮在lml琼脂固化培养基中，乘热倒入6厘米培养皿中。
(6)3天后显然可见细胞分裂，2周形成宏观克隆。
(三)展望
组织培养应用于作物育种的关键，在于从愈伤组织或悬浮培养体高频率再生植株。目前棉种组织培养能再生完整植株只有陆地棉(茎尖幼胚)和克劳次基棉(下胚轴)，可靠的大量产生再生植株的培养程序，还有待进一步研究肯定，种的范围也待扩大。一旦能取得高频率和生长健旺再生植株，才能有效地应用于棉花育种。
棉种幼胚培养拯救有性不亲和种间杂种取得成功，并结合秋水仙素处理取得了整倍体种间和属间(棉花×蓖麻)杂种，应用于遗传和育种研究，并已取得初步成果。
陆地棉花药培养，十多年来已明确了小孢子发育时期，启动愈伤组织和小孢子培养中有丝分裂和分化成茎、叶、芽、胚状体结果，更进一步深入分析研究，可望近期内取得再生植株。花药培养单倍体结合诱变技术，产生纯合“植株有脉体-种子无脉体”或消除锦葵酸中的环丙烯基环突变体，引入A，D基因型，然后掺入陆地棉，产生无毒种子，保持茎、叶、花高棉毒素这样的理想栽培品种。
棉花茎尖培养成功，为从单株直接克隆化大量繁殖同质无性系，和进行体细胞克隆变异研究，开辟新途径。应用这项技术于杂合个体，可供在不同环境条件下，评价分离体选育可能性。并能缩短新品种培育与繁殖大量种子供推广生产利用间所需年限。
棉属原生质体技术学激励着潜在应用于遗传操作。首先原生质体融合可能产生前所未有的体细胞杂种，能把野生种的有益基因转入栽培种陆地棉。核-质新组合能为杂种棉研究和生产和增加栽培品种细胞质多样性提供雄性不育细胞质和有性杂交无法研究的核-质遗传生理关系。最近开发了利用松弛素B达到细胞-细胞融合，以及电脉冲融合、电穿孔和注射(Electr-oinjection)。这些技术虽是八十年代中才提出的，但已取得可喜成果。并已设计生产了制备的成套设施，值得试用于棉种组织培养研究领域。
【参考文献】：
〔1〕Cen，M．，Z．Chen，C．Qian，C．Wang，Y．He，and Y．Xiao 1981 Investigation of ploidy in the process of anther culture of Hevea brasiliensis Muell-Arg．Acta Genet．Sin．8∶169-174．
〔2〕Chen，Z．，F．Chen，C．Chien，C．Wang，S．Chang，H．Hsu，H．Ou，Y．Ho，and T．Lu 1979 A process of obtaining pollen plants of Hevea brasiliensis MuellArg．Sci．Sin．22∶81-90．
〔3〕Z．Chen，C．Qian，M．Qin，C．Wang，C．Suo，Y．Xiao and X．Xu 1981 Relationship bet ween somatic cells and microsporesin the process of anther culture of Hevea brasiliensis Muell-Arg．Acta Bot．Boc-Occ．Sin．1∶31-37．
〔4〕Chen，Z．，C．Qian，M．Qin，X．Xu，Y．Xiao，M．D．Z．Lin，S．Wu and N．Huan 1981 Recent Advances in anther culture of rubber tree and sugarcane．In∶Annual Report of the Institute of Genltics，Acad．Sinica，Beijingp．103
〔5〕Paranjothy，K．and H．Ghandimathis 1975 Tissue and organ culture of rubber trel．In∶Symp．Intern．Rubber Conference．
〔6〕Hsi Yuan-Ling an d Wu King-In 1978 Callus formation induced from the anther culture of upland cotton(Gossypium hirsutumL．)Proc．Symp．on plant Tissue Culture，p．239-240．
〔7〕Price，H．J．and R．H．Smith 1979 Somatic embryogenesis in suspension cultures of Gossypium Klotzschianum Anderss．Planta 145∶305-307．
〔8〕Price，R．J．and R．M．Grumbles 1977 Callus cultures of six species of cotton(Gossypium L．)on defined media．Plant Sci．Lett．8∶115-119．
〔9〕Smith，R．H．，Price，H．J．andJ．B．Thaxton 1977 Defined conditions for fhe initiation and growth of cotton callus in vitro．I．Gossypium arboreum．In Vitro 13∶329-334．
〔10〕Stewart，J．McD．and C．L．Hsu 1977 In-ovulo embrvo culture and seedling development of cotton(Gossypium hirsutum L．)Planta，137∶113-117．
〔11〕Wang Tuefang and Hsi Yuanling 1986 Plantlet regeneration from shoot apex of Gossypium hirsutum L．Jiangsu J．Agric．Sw．2∶13-16．
〔12〕El-Shihy，O．M．and P．K．Evans 1986 Protoplast isolation，culture and plant regeneration of cotton(Gossypium barbadense L．)Intern．Cong．of plant Tissue and Cell Culture．Abstracts．University of Minisota，pp．52．
〔13〕浓曾佑、张圣章、颜季琼1978离体棉花胚珠的纤维生长和幼苗形成。植物生理学报，4∶183-187。
〔14〕王月芳、奚元龄、魏振承1986陆地棉茎尖培养成苗。江苏农学报，2卷2期。
〔15〕Bajaj，Y．P．S．1983 Haploid plant production In．Handbook of plant cell cul ture，vol，1．(D．A．Evans，P．V．Ammirato，W．R．sharp，and Y．Yamada，eds．)pp．228-290，Macmillan，New York．
〔16〕Collins，G．B．and P．D．Legg， 1979 Use of tissue and cell culture methods in to bacco improvement．In：Plant Celland Tissue Culture：Principles and Applications(W．R．Sharp，P．O．Larson，E．F．Paddock and V．Raghavan eds．)pp．585-614，Ohio State Univ．Press，Columbus．
〔17〕Evans，D．A．1983 Protoplast fusion In∶Handbook of Plant Cell Culture．vol．1(D．A．Evans，P．V．Ammirato，W．R．Sharp，and Y．Yamada，eds．)pp．124-178，Macmillan，New York．
〔18〕Flick，C．E．1983 Isolation of mutants from cell cultures In：Handbook of Plant Cell Culture，vol．1(D．A．Evans，P．V．Ammirato，W．R．Shavp and Y．Yamada，eds．)pp．393-441，Macmillan，New Y ork．
〔19〕Evans，D．A．and J．E．Bravo 1983 Protoplast isolatian and culture．In∶Handbook of Plant Cell Culture vo1．1(D．A．Evans，P．V．Ammirato，W．R．Sharp and Y．Yamada，eds．)pp．124-176，Macmillan，New York．
〔20〕Flick，C．E．，D．A．Evans and W．R．Sharp，1983 Organogenesis，In：Handbook of Plant Cell Culture，vol．1(D．A．Evans，P．V．Ammirato，W．R．Sharp and Y．Yamada，eds．、pp．13-81，Macmillan，New York．
〔21〕 Gleba，Yu Yu and D．A．Evans 1983 Transmission genetics of Somatic hvbrids．In∶Handbook of Plant Cell Culture．(D．A．Evans，P．V．Ammirato，W．R．Sharp and Y．Yamada，eds．)pp．322-357，Macmillan，New York．