第五节　分子生物学技术在肿瘤鉴别诊断中的应用

出处：按学科分类—医药、卫生 军事医学科学出版社《肿瘤病理鉴别诊断手册》第27页（1705字）

分子生物学技术在肿瘤诊断中的应用研究取得了不断的进步，从传统的临床病理形态组织学诊断进展到免疫组化、基因诊断。包括核酸杂交技术，可在新鲜与石蜡包埋组织进行Southern和Northern杂交，点杂交和原位杂交。所用探针由同位素标记物标记改进为应用生物素和地高辛标记，新近又开展了PCR-SSCP技术检测癌基因的扩增、突变、等位基因的缺失等，分析肿瘤的发生、诊断与预后的估价。但由于这些技术的操作比较复杂，阳性检出率、特异性和敏感性不足，多数尚不能实际应用于肿瘤基因诊断。

1985年Müller等创建了多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增技术，其具有特异、敏感(可将靶序列扩增百万倍)及快速(一般24h可完成)的特点。因而很快推广到肿瘤基因诊断方面，使某些肿瘤诊断取得了较大的进展。

到目前为止，比较成熟的已可用于实际肿瘤诊断与鉴别诊断的基因诊断技术有下列几方面：

(1)非何杰金淋巴瘤(T与B细胞淋巴瘤)克隆性基因重排检测：基于淋巴细胞由骨髓造血母细胞发育成成熟淋巴细胞要经过多次的基因重排。在不同阶段淋巴细胞转变为恶性淋巴瘤，呈单一克隆性增生。①Southern印迹杂交法检测：该法特异，检出率高，但必须采用新鲜组织，同位素标记探针，放射自显影。费时2周左右，不适合临床病例诊断；②PCR扩增技术：该法特异(理论上无假阳性)，敏感(单拷贝扩增百万倍)、快速(24h可完成)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)单克隆性增生，则扩增产物在电泳图上出现特定区域的单带，而因淋巴细胞良性增生，其各淋巴细胞基因编码不相同，故电泳图出现弥漫的涂片状宽带(smear带)，因而对良、恶性的鉴别起到独特的作用。当前国内外常用IgH基因和T细胞受体基因(TCR)检测B与T细胞淋巴瘤或淋巴细胞白血病。本技术尚存在10%～15%左右的假阴性。石蜡包埋组织的阳性检出率比新鲜组织低。为了提高阳性率，有采用三条引物的半巢式扩增法或多引物筑巢式扩增法。最高阳性检出率达90%以上。由于PCR扩增倍数很高，要严格防止污染，并要求严格评定电泳结果，以防止假阳性出现。Trainer提出评定电泳结果的四条标准：①单带宽度不超过1mm，边缘整齐；②单带出现在期望的碱基对(bp)范围之内；③如背景上无smear带，亦无引物二聚体，则表明扩增失败，而非阴性；④如果出现期望以外的其他条带，不能作为判断依据。鉴于上述原因，同时技术难度大，成本高，不能作为常规诊断技术，而只能应用于疑难、早期和微量标本(内镜活检、穿刺活检及涂片等)病例诊断，与组织学、免疫组化相结合，则将提高NHL的确诊率。是目前最先进的NHL确诊方法。

(2)B滤泡型淋巴瘤bcl-2基因蛋白产物免疫组化表达：国内外报告bcl-2蛋白表达结果在B滤泡型淋巴瘤瘤结节阳性，而增生淋巴滤泡生发中心阴性，外套区及滤泡间有部分淋巴细胞阳性。因此可用于确诊滤泡型淋巴瘤，或与增生淋巴滤泡相鉴别。其阳性率由78%上升到90%以上，故不失为滤泡型淋巴瘤与良性增生滤泡鉴别的有效方法之一。

(3)胰腺癌C-Ki-ras癌基因第12密码子点突变检测：先后发现人肝癌、肺癌及结肠癌中均有C-Ki-ras癌基因点突变，但阳性检出率较低。近年来研究发现人胰腺癌中有高频率的C-Ki-ras癌基因第12密码子点突变。Almoquera等发现20／22例(95%)，Smit等发现28／30例(93%)，Tada等检测18例全部(100%)阳性，国内李德春等报告28／34例(82．4%)阳性，而非癌组织阴性，因此应用PCR辅以核酸杂交或PCR产物测序检测胰腺癌组织(石蜡包埋组织也可)C-Ki-ras癌基因第12密码子点突变可能成为胰腺癌诊断与良、恶性鉴别的可靠分子生物学方法。