主要方法
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第61页（8084字）
(一)传代培养保存法
这种方法是一般检验室都在使用的方法。从保存厌氧菌为目的来说，应注意如下事项。
1．用于传代保存厌氧菌的培养基
(1)培养基中含糖类物质的浓度在可能的范围内应尽量降低。
(2)培养基中其他营养物质的浓度也只以能使生长发育为度。
(3)培养基中注意添加还原剂如硫乙醇酸盐、L－半胱氨酸等。
(4)尽可能使用新鲜或预还原处理后的培养基。
(5)许多厌氧菌能酵解碳水化合物产酸，故宜预先在保存培养基中加入弱碱性物如无水碳酸钙(0．1g／20ml)，或用几小片大理石代替。
(6)传代培养基中加入适量的琼脂(0．1%，0．25%，或0．5%，视琼脂牌号而异)，既可防止保存培养基干缩，又可阻止分子氧侵入培养基中。
(7)保存培养基中加入适量的Eh指示剂如美蓝水溶液或刃天青溶液(0．1～0．25mg%)。
2．注意培养温度和菌种保存的温度用于保存的菌种，一般选用稍低于厌氧最适温度进行培养(对人体分离菌，笔者实验室采用35℃)。以避免因繁殖速度过快，代谢产物浓度过高，使培养基的pH值改变而影响活菌数量。此外，保存温度以室温低于18～20℃避光保存为佳，否则极易造成保存菌株的死亡。这是因为低温时分子氧易进培养基之故。我们曾进行过比较，至4℃冰箱中传代保存厌氧菌2个月左右，约死亡80%，而在20℃左右的室温中保存同种厌氧菌，死亡率小于20%。
3．其他应注意事项
(1)从增菌培养基接种到保存培养基时，我们使用巴氏(Pasteur)吸液管吸取菌浓度1010／ml以上的菌液0．2ml，直接插入保存培养基试管的底部，注意勿将气泡带入，最好在过铜柱气体喷射下操作。不能用白金环(针)接种。在大气中操作时易使厌氧死亡。我们认为在厌氧菌罩中接种最好。
(2)一般1～3个月传代1次，不超过6个月，传代时间视所保存的菌种而异。
(3)为防止保存培养干缩，可加灭菌的20%甘油或1cm厚的灭菌液体石蜡，用异丁烯橡胶塞或螺盖拧紧。
(4)被保存的菌株至少传种2管(笔者传种3～5支小试管)。
(5)进行保存菌株时应定时对其性状(生化性状、菌落形态、革兰氏染色性和菌体形态及色素产生等)做检查。
4．传代培养基的选择 不同属种的厌氧菌选择相应的培养基保存。
(1)放线菌肉汤培养基：硫酸钾15．0g，硫酸镁0．2g，氯化钙0．01g，肉膏25．0g，葡萄糖5．0g，半胱氨酸1．0g．酵母5．0g，可溶性淀粉1．0g，胰酶酪蛋白4．0g，蒸馏水100ml，pH6．9。
(2)韦荣氏球菌培养基：胰酶酪蛋白5．0g，酵母3．0g，乳酸钠15．0g，硫乙醇酸钠0．75g，吐温－800．75，葡萄糖1．0，蒸馏水1000ml，pH7．5。
(3)巨形球菌培养基：硫酸二氢钾1．6g，磷酸氢钾3．2g，60%乳酸钠1．6ml，酵母4．0g，氯化胺0．5g，氯化钙0．2g，硫乙醇酸钠0．45g，氯化镁0．2g，琼脂1．0g，蒸馏水1000ml，pH7．0。
(4)庖肉培养基：新鲜配制的牛肉浸液和牛肉渣，按10∶1装入，上盖3～4mm凡士林，高压灭菌后备用。
笔者认为，芽孢厌氧菌使用庖肉培养基，一般无芽孢厌氧菌使用GMA培养基为好。无芽孢厌氧菌如用庖肉培养基，保存时间短，效果也差。
(5)GMA培养基：
蛋白胨10．0g，胰蛋白胨10．0g，大豆3．0g，肉浸膏1．2g，酵母浸膏5．0g，可溶性淀粉0．3g，肝浸膏1．2g，0．05%氯化血红素溶液10ml，氯化钠3．0g，L－半胱氨酸0．3g，硫乙醇酸钠0．3g，葡萄糖2．5g，磷酸－氢钠2．5g，琼脂1g，蒸馏水100ml，pH7．2。
(6)评价：传代保存厌氧菌的方法比较简便，操作条件和技术要求不高，容易做到和推广，效果可以。不足之处：①易污染杂菌或引致死亡；②易发生包括生化性状、菌体形态、菌体形态、色素产生、毒力、抗结构等遗传性状的变异；③大批菌种保存仍然费时费力，定时传代也费事。菌种在传输途中不方便。
(二)预还原灭菌培养基保存法
1．方法 预还原灭菌培养基开始由Hungate在无氧条件下使用转管法(Roll tube method)，以后又改进为气体喷射法制作。国内已有过铜柱装置。方法都是将二氧化碳气流通过铜柱，使其成为高度除氧，在高纯度二氧化碳喷射下排除培养基中的氧气，再移殖或接种细菌至预还原灭菌的培养基上。其注意事项与传代保存法同。铜柱中的铜使用后，可以通过氢气还原，反复使用。
2．用途 此法开始于医学微生态学研究中，后在日本等国较广泛地用于厌氧菌的保存中，一般用预还原GMA培养基加入几小片无菌大理石，能保存多种无芽孢厌氧菌，保存6个月至1年已获成功。尤其用于从口腔分离的产黑色素普氏杆菌等，保存效果好。我们从日本引进的参考菌种就是用此法保存的。开启上述引进菌种时，存活率也较高。
3．评价 本法因接种、培养过程都在高纯度的二氧化碳气中进行，除在厌氧菌的分离、分纯、培养时使用外，还用于菌种的保存。此法要求一定设施，操作仍较繁杂，实验室如具上述条件即能应用。
Justesen等发现，在纯二氧化碳环境中，几乎完全抑制了梭状芽孢杆菌属中的产气荚膜杆菌的生长，此外消化链球菌属如暴露于其中，经1小时也可受到抑制或杀死，对脆弱类杆菌则无影响。因此，在保存梭菌属和消化链球菌属时用此法则应注意其不良后果。
(三)低温保存法
对于易致死亡较难保存的无芽孢厌氧菌，最好选用低温保存法。用此法，有时可保存厌氧菌长达数年。
1．预冻措施 厌氧菌在低温保存过程中，容易形成菌细胞外部和内部冻结，视冷冻速度保存的菌细胞大小及种类而异。因此使用低温时，应尽可能避免细胞内冻结。一般都应预冻。此外，对数期生长繁殖的菌细胞最好使用低温保存，因它们对低温抗力强。例如笔者对脆弱类杆菌菌株用24～48小时的培养物，优杆菌属则选用36～72小时的培养物为好。同时还选择较高菌浓度来保存，菌浓度越高，存少率越高，保存期也长。笔者将要保存的菌选用最佳增菌培养基，先增菌后再保存。准备用低温保存的菌液，一般不宜加电解质(如氯化钠)。即使要加入，也应尽量把含量控制在最小范围内，因为氯化钠的共晶点为－21．6℃。如用含有较大浓度氯化钠的菌液，在达到共晶温度时，菌细胞易处于盐的有害作用致细胞变性。
2．防冻剂和分散剂的选择 低温保存厌氧菌过程中，为防止胞内或胞外冻结，宜在保存的菌液中加入适量的防冻剂。常用的防冻剂有：①15%～20%灭菌甘油，可防止胞外冻结；②10%二甲基砜(DMSO)也有防冻作用。上述浓度的甘油、二甲基砜以1∶1的比例加入，防冻效果更好。添加防冻剂时宜注意：防冻剂加入浓菌液时宜先静置15分钟左右，后尽快地预冻。
分散剂是用于菌种细胞在冷冻干燥过程中免受破坏的某些物质，它们也具有防冻作用，常用的是：
(1)脱纤维羊血、兔血或马血，美国疾病控制中心常用脱纤维羊血；日本光冈等常用脱纤维马血；笔者用脱纤维兔血和羊血，效果都不错。
(2)脱脂牛乳，铃木、上野氏等常用灭菌的20%脱脂牛乳，加入浓菌悬液或直接从培养皿上刮菌加入，他们用此法保存过许多厌氧菌株，即使较难保存的具核杆菌和产黑色素普氏杆菌等，用此法作分散剂，也能存活2年以上，韦荣氏球菌可存活10年。笔者用20%脱脂牛乳加入0．1%谷氨酸钠和0．03%L－半胱氨酸，或单一地用20%脱脂牛乳，保存了脆弱类杆菌、普通类杆菌、消化链球菌、具核梭杆菌等10多种厌氧菌株，9个月后仍证明存活。
(3)含7．5%葡萄糖的马血清。
(4)等量的脱纤维羊血和脱脂牛乳，效果也不错。
3．评价 低温保存厌氧菌菌种方法比较简便易行，只要有低温冰箱即可(笔者用－30℃低温冰箱)。它比传代保存法优越，保存时间较长，且不易发生污染和变异。此法不如用液氮保存法存活率高，但是较液氮保存法节约。如采用得法，效果是很好的。
(四)液氮保存法
这是保存厌氧菌最好的方法，其存活率高，操作又较简便，只要具备液态氮，使用此法最可靠。
1．方法
(1)预冻措施一般以每分钟温度下降1℃左右的速度预冻，最好置于95%乙醇干冰中预冻，时间大约30～60分钟。笔者先置普通冰箱(4℃)经10分钟，再移入－30℃低温冰箱中经20分钟，再置液氮瓶中，效果较好。
(2)置液氮瓶灌中，液氮瓶分大、小两种，小瓶最大10L，大瓶最大100L以上，装罐时可将一般安瓿(一定要能耐低温的)放入L型挂筒中，也有人(用塑料安瓿的，笔者用螺旋盖特制玻璃安瓿)把挂杆压于液氮瓶口的竖沟内，压紧盖即可。大液氮罐一般分贮藏槽和液氮槽两部分，中间有通气道，装罐方法同上。
(3)液氮加样后，应根据位计和试样测温器添加液氮和调节槽温。
2．注意事项
(1)装罐时，操作者要预防在操作时被冻伤。
(2)注意保存菌的安瓿要熔封密闭。
(3)安瓿管一般应用含硅玻璃等特制，或使用塑料管、聚脂袋盛装样品。
(4)注意液氮的残存量，宜定时、定量添加，一般估计每周可蒸发1／10容量，适当添加液氮。
笔者用脱纤维羊血、脱纤维羊血加牛乳、20%脱脂牛乳和脱纤维兔血，以甘油等作分散剂和防冻剂，封好安置液氮罐中。已保存普通类杆菌、脆弱类杆菌、消化链球菌、优杆菌等10多种厌氧菌，历时24个月，存活情况良好(表2－1)。最近笔者又用此法保存了二氧化碳嗜纤维菌属(Capnocytophaga)的3个菌株，以及产黑色素普氏杆菌等几个菌株，半年内存活情况良好。
表2－1 脆弱类杆菌液氮保存法存活情况
注：“+++”应存活良好；“++”示存活尚好；“+”示仍有存活。
3．评价 液氮保存厌氧菌的方法是目前最好的保存方法，与其他方法相比，此法技术操作简单，保存效果最好，但需具备液氮罐，且由于液氮蒸发较快，每周都需注意定量添加液氮，这在基层单位是难以办到的。液氮价格较贵，如需长期保存菌种，有的单位难于坚持施行。相比之下，低温保存法比液氮法较方便，适于在基层单位推广。
(五)冻冷干燥保存法
1．原理 已冷冻的厌氧菌在减压时，因升华除去水分，菌细胞除去大部分水分后，其生理活动处于最微弱的状态，被保存的菌株能长期维持存活状态。
2．注意事项
(1)选择营养丰富的培养基增菌：使准备以冷冻干燥法保存的菌株的浓度达109～1010／ml以上。
(2)一般用静止期菌细胞冷冻干燥。
(3)分散剂：主要用10%～20%脱脂牛乳，或含7．5%葡萄糖的血清，10%乳糖(加入0．1%谷氨酸钠)溶液干燥合剂(见下述配制法)等。分散剂使用前，置沸水中煮沸15分钟，驱逐气体后立即冷却，含血清的分散剂要在滤过灭菌后置厌氧菌环境中预还原24小时以后备用。①含7．5%葡萄糖血清的配法：不含水的葡萄糖3．0g，加于不含防腐剂自然凝固后的无菌马血析出血清40ml中，用蔡氏滤菌器过滤。②干燥合剂的配法：葡萄糖3．0g，普通肉汤粉0．13g，加蒸馏水10ml，徐徐地加入不含防腐剂马血清30ml，混合均匀，滤过灭菌后分装安瓿。③笔者使用的分散剂是20%脱脂牛乳，加入0．1%谷氨酸钠和0．03%L－半胱氨酸，也有保存效果。
(4)迅速地预冻：可选用干冰(固相CO2)、95%乙醇，或在－30℃以下的低温冰箱中进行，应尽快地将要保存的菌株处于冻结状态。一般将它们置于－80℃低温冰箱中30～60分钟。
(5)冷冻机和干燥剂的选择：冷冻干燥过程一般是在冷冻干燥机内进行，选择冰冻时间短些，干燥效果好的冷冻干燥机为好。冷冻干燥时间的温度宜在－30～－40℃以下。干燥剂可选择：①无水硫酸钙(其再生温度为230～250℃)②硅胶和活性氧化铝(其再生温度为150℃和175℃)；③无水氯化钙或五氧化二磷(干燥作用强，但不能再生)；④笔者使用的钙5A型分子筛(上海分子厂生产)效果较好(其再生温度为210～230℃)。一般说来对厌氧菌的存活，冷冻干燥时间越短越好。干燥终点的判定，笔者以一盛有1%～2%氯化钴的安瓿来判断，当安瓿呈深蓝色时则判为干燥已达终点。有时也可从冷冻干燥机孔来进行观察，一旦干燥成可脱落的块状时也认为已达干燥终点。
(6)菌种干燥后应在同时抽真空的情况下，用真空度检测器检测，发现测管内呈显紫红色光时，则封口。已干燥好的菌种管置暗处冷藏为宜。有人试验，在不同温度与管内已冷冻干燥菌种的存活关系，证明冷藏比室温下保存的存活率要高。
3．评价 冷冻干燥法适于大多数厌氧菌种的保存，并利于贮存和输送，国外菌种保藏中心如ATCC(美)、NTCT(英)都使用此法保存厌氧菌株。从目前国内情况来看，用此法保存厌氧菌菌种，存活情况一般尚不够理想，这可能与如下几点有关。
(1)选择分散剂不够理想，厌氧菌中许多不能抵抗冷冻干燥过程而死亡。
(2)预冻和干燥时间过长，尤其是后者，冷冻干燥过程太长，对需氧菌影响不大，可是厌氧菌不能耐受分子氧的毒性作用。目前不少国产的菌种干燥机，干燥过程需要36小时以上，效果不好。
(3)菌种管封口时接触大气时间较长或由于封后的菌种管内真空度不够，尤其是干燥终点尚未达到的菌种管易致菌死亡。分子氧对厌氧菌的毒性作用在厌氧菌细胞膜的DNA合成部位，由于合成DNA受阻而致死。
(4)干燥后的菌种管未置暗处避光冷藏。菌种复苏时，除了选择最佳的培养基外，操作应尽可能避免在大气中进行。若有条件，在厌氧菌罩中操作较好。总之，厌氧菌的冷冻干燥过程比一般需氧菌要求特殊、严密。重要原则是：每一个环节都应尽量缩短与大气接触的时间，只有这样才能保证冷冻干燥后的厌氧菌株有较高的存活率。
笔者曾做过传代保存、低温保存、冷冻干燥保存和液氮保存等法，保存脆弱类杆菌等10余种厌氧菌菌种，并做了比较(表2－2)。
表2－2 4种菌种保存效果比较
注：1．表中分母数字代表开启复苏的菌株数；分子代表存活的菌株数；括号内分数是为比较统一为10分之几。*表示保存月数。
2．由于此时参加全国厌氧菌数值考核鉴定工作，需要提供菌株，影响了传代保存的菌株数。
3．★时因实验室停电8天以死菌太多，未能进行比较试验。
从表2－2中可见，厌氧菌最好的方法是液氮法，其存活率最高，但需定期地添加液氮，既不经济也较繁琐，尤其是携带运输不便。这是其不足之处。低温保存法存活率也较高，它比液氮法方便，但受电源供应的影响，笔者可因此造成不可弥补的损失。冷冻干燥法存活率虽不如上两法，但它远比传代保存法优良，携带运输也方便。不难理解，传统的时代保存法对于厌氧菌种的保存显得弊多利少一些。笔者认为虽各法有其长短，但在实验室中，一个菌种如能利用上述方法中的几种方法保存，就可取长补短，较稳妥无误。
(六)其他方法
在厌氧菌菌种的保存方法中，尚有明胶片干燥保存法和毛细套管保存法等。明胶片干燥法是将含有明胶的分散剂制备的浓度菌液109～1010／ml滴于蜡纸上真空干燥，呈大小均匀的盘状物，或将含有明胶的分散剂制备的浓菌液滴于无色硅胶(其大小6～16目)粒上，进行干燥，此法的优点是简便。铃木曾用此法保存脆弱类杆菌，存活2年以上。
毛细套管保存法是将浓菌液装入灭菌的小管内，再将小管装入底部置有干燥剂的大试管中，大试管用插有玻璃毛细管的硬质橡胶塞封紧，毛细管上端与真空泵连接，抽真空后封毛细管口即可。此法简便，但保存厌氧菌的时效有待反复实验后再加以说明。