液相变性速率法

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第103页（1441字）

这个方法依据细菌等原核生物的基因组DNA通常不包含重复顺序。它们在液相中变性(杂交)时，同源DNA比异源的变性速度要快。同源程度越高，变性速率越快，杂交率也越高。利用这个特点，可以通过分光光度计直接测定变性DNA在一定条件下的变性速率，进而用理论推导的公式来计算DNA-DNA之间的杂交(结合)率。

1．DNA样品的处理 用溶菌酶或SDS等破壁提取DNA丝状物(提取方法同前)。试验前需先置冰浴中，超声处理4次，每次15秒，间隔1～2分钟，使DNA片段的分子量约为2．4×10⁵，用超声破壁提取的DNA溶液，不再做超声处理。

2．DNA变性 将超声处理后的待测样品A、B，分别用0．1SSC精确配制成OD260为1．5或2．0溶液(约5ng／ml)，取样品A、B各3ml，分别放在2支试管里，再取A、B各1．5ml装在同一试管中混匀为样品M。测试前，将A、B、M三个样品分别置沸水中变性10分钟，用预热的1ml试管吸预热的10SSC0．72ml，加入上述变性样品中，稍加混匀，使最终浓度为2SSC。

3．测定DMA的变性速率

(1)选择测量条件：校正分光光度计后，选择时间扫描，固定260nm波长，选择3mm／分钟的扫描速度，自动控制时间，并使记录纸的量程放大2～2．5倍。

(2)预热比色架和比色杯：打开超级恒温器，用热循环水预热比色架及盛有2SSC的1cm比色杯，用半导体点温计通过热敏电阻探针监测杯中溶液的温度，使之稳定在最适宜变性温度(TOR)。

TOR=0．51×(G+C)mol%+47．0

(3)上样：待达到TOR后，弃去比色杯中的2SSC液，迅速转入变性DNA样品液，同时接通热敏电阻，观察温度，全部过程不得使样品的温度低于TOR。

(4)测定变性反应：待被测样品的温度达到TOR时，开始记录相应的吸光度，以此为零时，随后每隔5分钟读数1次，待反应进行到30分钟时停止扫描，最终得一条随时间延长吸光度逐渐减少的直线。

(5)计算变性速率：零时吸光度减去30分钟时间吸光度，除以总时间(30分钟)，得出直线的斜率，即DNA的变性速率，每个样品应重复测2～3次。

4．细菌DNA杂交率的计算 待按上法得到的A、B及其混合物(M)的变性速率代入公式，即可得出两个菌株DNA杂交百分数。

Va、Vb、Vm分别表示A、B、M三个样品的变性速率。

DNA变性的速率可以反映不同样品之间碱基顺序的互补程度。如果两种DNA的顺序相同，它们的混合物变性速率(Vm)与分别测得的单一样品的变性速率(Va和Vb)相同。反之，如果两种DNA的碱基顺序完全不同或部分不同时，其复合物的变性率可表现出不同程度的减慢。