维生素B6的测定
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第155页（6249字）
方法一：维生素B6的荧光测定法
样品在硫酸存在下，加压加温水解，采用CGS树脂，用柱层析分离，以氯化钾的磷酸缓冲液洗脱。洗脱液在二氧化锰和乙醛酸钠溶液存在下，可使维生素B6一次转化为吡哆醛，它在氰化钾作用下，生成荧光物质吡哆醛氰醇衍生物。用荧光分光光度计测定之，从而计算出维生素B6的含量。
试剂
(1)0．44N硫酸溶液。
(2)0．055N硫酸溶液。
(3)6N氢氧化钾溶液。
(4)6N硫酸溶液。
(5)2M乙酸钾溶液：取2M乙酸钾溶液，以醋酸调节pH至4．0。
(6)CGS树脂(100～120目)处理：称250克CGS树脂置烧杯中，加入3N盐酸750毫升。室温下搅拌30分钟，静置过夜，弃去上清夜。再加入6N氢氧化钾500毫升，室温搅拌30分钟，静置分层后弃去上清液，水洗至中性。弃去上清液，加入3N盐酸750毫升，于沸水浴搅拌30分钟，弃去上清液，再重复用盐酸处理二次，水洗至中性，加入6N氢氧化钾溶液500毫升，室温搅拌1小时，水洗至中性，贮于pH4．0的2M乙酸钾溶液中，摇匀备用。
(7)0．01M醋酸缓冲液(pH4)：称1．36克醋酸钠溶于水中并定容至1000毫升，以醋酸调节至pH4．0。
(8)0．02M醋酸缓冲液(pH5)：称2．72克醋酸钠，溶于水中并定容至1000毫升，以醋酸调节至pH5．0。
(9)1．5M氯化钾－0．1M磷酸氢二钾缓冲液(pH8．0)：称112g氯化钾，22．8g磷酸氢二钾，溶于水并定容至1000毫升。以醋酸调节至pH8．0。
(10)0．02M醋酸缓冲液(pH5．5)：称2．72克醋酸钠，溶解于水并定容至1000毫升。以醋酸调节至pH5．5。
(11)0．05M乙醛酸钠；
(12)二氧化锰催化剂：
①饱和高锰酸钾：称25克高锰酸钾，加入250毫升水，搅拌溶解，温度维持在25℃～28℃备用。
②硫酸锰溶液：称15克硫酸锰，置200毫升90℃水中搅拌均匀。
③将②硫酸锰溶液于90℃溶解后，边搅拌边加入260毫升高锰酸钾溶液，搅拌反应15分钟，冰水冷却，以布氏漏斗过滤。用80℃热水分二次洗滤瓶，每次用100毫升，再用甲醇分二次洗涤滤瓶，每次用150毫升。过滤后于50℃烘箱烘2．5小时，然后，取出研碎，继续烘干。用100目筛过筛，贮于磨口瓶内备用。
(13)0．1M EDTA－二钠溶液。
(14)1M氰化钾溶液。
(15)硫酸奎宁溶液：称6毫克硫酸奎宁溶于100毫升0．1N硫酸溶液中。
(16)1M磷酸氢二钾溶液。
(17)5mM明矾溶液。
(18)维生素B6标准溶液。
①盐酸吡哆醛溶液(10．0微克／毫升)：称盐酸吡哆醛65毫克，用0．44N硫酸溶解，并于10毫升容量瓶中用0．44N硫酸定容。取以上溶液0．469毫升置250毫升容量瓶中，以0．4N硫酸溶液定容。
②盐酸吡哆醇溶液(10微克／毫升)：称盐酸吡哆醇65毫克，溶于0．44硫酸溶液中，定容于10毫升容量瓶中，取以上溶液0．468毫升，定容于250毫升容量瓶中(用0．44N硫酸定容。)
③盐酸吡哆胺溶液(10微克／毫升)：称盐酸吡哆胺75毫克，溶于0．44N硫酸溶液中，定容于10毫升容量瓶中，取以上溶液0．478毫升，定容于250毫升容量瓶中(用0．44N硫酸溶液定容)。
(19)荧光分光光度计。
(20)手提式高压灭菌锅。
(21)pH酸度计。
操作步骤
1．样品液的制备：称粉碎研细样品1．00克，置150毫升三角瓶中。
取另一150毫升三角瓶，加入维生素B6标准溶液，即盐酸吡哆醛0．8毫升，盐酸吡哆醇0．8毫升和盐酸吡哆胺溶液0·8毫升。
将以上样品瓶和标准瓶中，分别加入90毫升0．44N硫酸溶液，摇匀，置高压灭菌锅中，于温度121℃，压力670KPa水解2小时(动物样品用0．055N硫酸水解5小时)。停止加热40分钟后，取出三角瓶冷却，用6N氢氧化钾调至pH4·0，定容至100毫升，过滤，滤液备用。
2．装柱：取二支1×30cm的层析柱，用经过处理的CGS树脂进行湿装柱，每支装高度为9cm，装完柱后，柱内无气泡。然后用70℃～80℃热去离子水约200毫升洗柱。用电子微量泵控制流速为5毫升／分，再用70℃～80℃的0．01M，pH4·0的醋酸缓冲液洗柱，用量约80毫升。流速同上。待冷至室温时，即可进样。
3．进样和洗脱：准确吸取10～50毫升样品液(约含维生素B61～7．5微克)进样。流速控制在0．25毫升／分)。
用pF5．0，0．02M醋酸缓冲液50毫升洗脱，洗脱流速为0．6毫升／分，最后用70℃～80℃的，pH8．0，0．1M磷酸氢二钾缓冲液洗脱。流速为0．6毫升／分。
收集约48毫升洗脱样液，置50毫升容量瓶中，用6N盐酸调节至pH5．0，定容至刻度。
准确吸取25毫升标准维生素B6水解液，过第二根柱，操作同上。
4．样液制备：分别吸取18毫升样品层析液和标准维生素B6层析液，置50毫升三角烧瓶中，各加入0．02M，pH5．5的醋酸缓冲液2毫升。5mM明矾液0．25毫升，0．05M乙醛酸钠0．7毫升，二氧化锰40毫克，将三角瓶置一小漏斗于100℃恒温水浴中不断振荡30分钟，取出冷却，过滤至25毫升比色管中，以2×1．5毫升1M磷酸氢二钾洗涤小漏斗，移入比色管中，加入0．3毫升0．1MEDTA－二钠溶液，定容至25毫升。
5．荧光性物质吡哆醛氰醇衍生物的形成：取10毫升比色管4支，分别编号。1号管加入9．0毫升上述样品液作为样品对照管。2号管加入9．0毫升样品液后，再加入0．2毫升1M氰化钾溶液作为样品反应管。
3号管加入9．0毫升上述制备的标准维生素B6溶液作为标准对照管。4号管加入9．0毫升标准维生素B6溶液，再加入0．2毫升1M氰化钾溶液，作为标准反应管。
然后将第1～4号管分别滴加6N盐酸或氢氧化钾调节pH为7．2～7．4。于50℃恒温水浴中反应90分钟，取出冷却，再滴加6N氢氧化钾调节至pH9．5后，加水稀释至刻度，摇匀，静置30分钟。
6．测定：用荧光分光光度计，以每毫升0．6微克的硫酸奎宁(以1cm石英比色皿)调节100，激发波长(λEX)=355nm，发射波长(λEM)=434nm。
分别依次取标准维生素B6或样品溶液的对照管和反应管，置1cm石英比色皿中，在波长355nm光激发下，测定434nm发射荧光强度。
7．计算：
式中：F：样品反应管的发射荧光强度；
F′．样品对照管的发射荧光强度；
F0：标准维生素B6反应管的发射荧光强度；
F′0：标准维生素B6对照管的发射荧光强度；
C：25毫升标准维生素B6比色管中的维生素B6(PL、PN、PM)之浓度(微克／毫升)；
W：样品重量(克)；
V：样品水解后定容体积(毫升)；
V1：进层析柱的样品溶液的体积(毫升)。
方法二：维生素B6的比色测定
维生素B6与2，6－二氯醌氯亚胺反应生成蓝色靛酚，在650nm处具有最大吸收，维生素B6含量在3～8微克／毫升时，符合比尔定律。
试剂
(1)2，6一二氯醌氯亚胺溶液：称2，6－二氯醌氯亚胺40毫克溶于100毫升异丙醇中。冰箱贮存一个月，如果变成粉红色不能再用。
(2)氢氧化铵－氯化铵缓冲液：将16克氯化铵溶于70毫升水中，再加浓氨水(27%)16毫升，加水定容至100毫升。过滤后使用。
(3)标准维生素B6贮备液：称盐酸吡哆醇25毫克，溶解在250毫升0．1N盐酸中，置棕色瓶中，冰箱可保存三个月(此液为0．1毫克／毫升)。
标准维生素B6应用液：取贮备液10．0毫升，用蒸馏水定容至100毫升。(此液10微克／毫升)。
(4)4N盐酸和浓盐酸。
(5)2N氢氧化钠。
(6)异丙醇。
(7)20%醋酸钠溶液。
(8)2．5%硼酸溶液。
(9)磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液：称73克磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)，167克柠檬酸溶于水中，稀释至1000毫升(pH3)。
(10)吸附剂：水合硅酸铝。
(11)酸化水：合0．001N盐酸。
操作步骤
1．样品液的制备：称粉碎研细的样品1克(约含维生素B630～200微克)，置20毫升离心管中，加10毫升4N盐酸，置沸水浴中1小时并不时搅拌。冷却后调pH至3。加入磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液(pH3)3毫升。再加入2．5克吸附剂(水合硅酸铝)，塞紧离心管，振荡5分钟。离心并弃去上清液。用15毫升酸化水洗涤沉淀物1次。离心弃去上清液。再加入5毫升2N氢氧化钠溶液，并加水至20毫升。剧烈振摇3分钟，使吸附剂分散呈悬浮状态，离心，吸取5毫升离心液，加入25毫升异丙醇，混合后离心，收集上清液，用浓盐酸调节pH至6(此为样品液)。
2．测定
(1)取四支带塞试管。每管加入5毫升样品液，2毫升氢氧化铵－氯化铵缓冲液。
(2)第一管加2毫升2．5%硼酸溶液。
第二、三管各加蒸馏水2毫升。
第四管中加2毫升维生素B6标准工作液。
(3)第一管中快速加入1毫升2，6－二氯醌氯亚胺溶液，混匀振摇10秒钟使其显色。加入显色剂后，准确60秒钟，立即在650nm处，调光密度为零(1cm比色皿)。
第二管快速加入1毫升2，6－二氯醌氯亚胺溶液，振摇混匀10秒钟，从加入显色剂后计算60秒钟，立即进行比色测定，记下光密度值。
第三、四管也同样处理，测定其光密度值。
3．计算
式中：A：样品液(2和3管)光密度平均值；
B：标准维生素B6工作液及样品液(4管)光密度值：
W：样品重量(克)；
20：标准维生素B6盐酸盐含量(微克)；
5：样品测定液的体积(毫克)；
30：样品稀释液的体积(毫升)；
5：用于稀释的样品液体积(毫升)；
20：样品液体积(毫升)；
1000：换算微克为毫克的系数；
100：换算为百分含量。