食品卫生微生物学检验 罐头食品商业无菌的检验(摘自GB4789．26)
出处：按学科分类—工业技术 中国轻工业出版社《软饮料工业手册》第1016页（7743字）
(一)主题内容与适用范围
本标准规定了罐头食品商业无菌检验的基本要求、操作程序和结果判定。
本标准适用于各种密封容器包装的，经过适度的热杀菌后达到商业无菌，在常温下能较长时间保存的罐头食品。
(二)术语
1．罐头食品的商业无菌(commercial sterilization of canned food)
罐头食品经过适度的热杀菌以后，不含有致病的微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖的非致病性微生物，这种状态称作商业无菌。
2．密封(hermetical seal)
密封是指食品容器经密闭后能阻止微生物进入的状态。
3．胖听(swell)
胖听是指由于罐头内微生物活动或化学作用产生气体，形成正压，使一端或两端外凸的现象。
4．泄漏(leakage)
泄漏是指罐头密封结构有缺陷，或由于撞击而破坏密封，或罐壁腐蚀而穿孔致使微生物侵入的现象。
5．低酸性罐头食品(low acid canned food)
低酸性罐头食品是指除酒精饮料以外，凡杀菌后平衡pH大于4．6、水分活性值大于0．85的罐头食品。原来是低酸性的水果、蔬菜或蔬菜制品，为加热杀菌的需要而加酸降低pH的，属于酸化的低酸性罐头食品。
6．酸性罐头食品(acid canned food)
酸性罐头食品是指杀菌后平衡pH等于或小于4．6的罐头食品。pH小于4．7的番茄、梨和菠萝以及由其制成的汁，以及pH小于4．9的无花果都算作酸性食品。
(三)设备和仪器
(1)超净工作台。
(2)冰箱 4℃。
(3)恒温箱 30±1℃、36±1℃、55±1℃。
(4)显微镜 带油镜头。
(5)电子秤或台天平。
(6)接种环。
(7)卫生开罐刀和罐头打孔器。
(8)白色搪瓷盘。
(9)电位pH计。
(10)灭菌试管、吸管、平皿。
(11)酒精灯。
(12)灭菌镊子。
(四)培养基和试剂
(1)革兰氏染色液。
(2)疱肉培养基。
(3)溴甲酚紫葡萄糖肉汤：见附录AA1。
(4)酸性肉汤 见附录AA2。
(5)麦芽浸膏汤 见附录AA3。
(6)锰盐营养琼脂 见附录AA4。
(7)血琼脂。
(8)卵黄琼脂。
(9)75%酒精溶液。
(五)检验步骤
1．审查生产操作记录
工厂检验部门对送检产品的下述操作记录应认真进行审阅。妥善保存至少三年备查。
(1)杀菌记录 杀菌记录包括自动记录仪的记录纸和相应的手记记录。记录纸上要标明产品品名、规格、生产日期和杀菌锅号。每一项图表记录都必须由杀菌锅操作者亲自记录和签字，由车间专人审核签字，最后由工厂检验部门审定后签字。
(2)杀菌后的冷却水有效氯含量测定的记录。
(3)罐头密封性检验记录 罐头密封性检验的全部记录应包括空罐和实罐卷边封口质量和焊缝质量的常规检查记录，记录上应明确标记批号的罐数等，并由检验人员和主管人员签字。
2．抽样方法
可采用下述方法之一。
(1)按杀菌锅抽样 低酸性食品罐头在杀菌冷却完毕后每杀菌锅抽样2罐，3kg以上的大罐每锅抽1罐，酸性食品罐头每锅抽1罐，一般一个班的产品组成一个检验批，将各锅的样罐组成一个样批送检，每批每个品种取样基数不得少于3罐。产品如按锅划分堆放，在遇到由于杀菌操作不当引起问题时，也可以按锅处理。
(2)按生产班(批)次抽样
①取样数为1／6000，尾数超过2000者增取1罐，每班(批)每个品种不得少于3罐。
②某些产品班产量较大，则以30000罐为基数，其取样数按1／6000计，超过30000罐以上的按1／20000计，尾数超过4000罐者增取1罐。
③个别产品产量过小，同品种、同规格可合并班次为一批取样，但并班总数不超过5000罐，每个批次取样数不得少于3罐。
3．称重
用电子秤或台天平称重，1kg及以下的罐头精确到1g，1kg以上的罐头精确到2g。各罐头的质量减去空罐的平均质量即为该罐头的净重。称重前对样品进行记录编号。
4．保温
(1)将全部样罐按下述分类在规定温度下按规定时间进行保温，见表5－3－4。
表5－3－4
(2)保温过程中应每天检查，如有胖听或泄漏等现象，立即剔出作开罐检查。
5．开罐
取保温过的全部罐头，冷却到常温后，按无菌操作开罐检验。
将样罐用温水和洗涤剂洗刷干净，用自来水冲洗后擦干。放入无菌室，以紫外线杀菌灯照射30min。
将样罐移置于超净工作台上，用75%酒精棉球擦拭无代号端，并点燃灭菌(胖听罐不能烧)。用灭菌的卫生开罐刀或罐头打孔器开启(带汤汁的罐头开罐前适当振摇)，开罐时不能伤及卷边结构。
6．留样
开罐后，用灭菌吸管或其他适当工具以无菌操作取出内容物10～20mL(g)，移入灭菌容器内，保存于冰箱中。待该批罐头检验得出结论后可随之弃去。
7．pH测定
取样测定pH，与同批中正常罐相比，看是否有显着的差异。
8．感官检查
在光线充足、空气清洁无异味的检验室中将罐头内容物倾入白色搪瓷盘内，由有经验的检验人员对产品的外观、色泽、状态和气味等进行观察和嗅闻，用餐具按压食品或戴薄指套以手指进行触感，鉴别食品有无腐败变质的迹象。
9．涂片染色镜检
(1)涂片 对感官或pH检查结果认为可疑的，以及腐败时pH反应不灵敏的(如肉、禽、鱼类等)罐头样品，均应进行涂片染色镜检。带汤汁的罐头样品可用接种环挑取汤汁涂于载玻片上，固态食品可以直接涂片或用少量灭菌生理盐水稀释后涂片。待干后用火焰固定。油脂性食品涂片自然干燥并火焰固定后，用二甲苯流洗，自然干燥。
(2)染色镜检 用革兰氏染色法染色，镜检，至少观察5个视野，记录细菌的染色反应，形态特征以及每个视野的菌数。与同批的正常样品进行对比，判断是否有明显的微生物增殖现象。
10．接种培养
保温期间出现的胖听、泄漏，或开罐检查发现pH、感官质量异常、腐败变质，进一步镜检发现有异常数量细菌的样罐，均应及时进行微生物接种培养。
对需要接种培养的样罐(或留样)用灭菌的适当工具移出约1mL(g)内容物，分别接种培养。接种量约为培养基的十分之一。要求在55℃培养基管，在接种前应在55℃水浴中预热至该温度，接种后立即放入55℃温箱培养。
(1)低酸性罐头食品 每罐接种培养基、管数及培养条件见表5－3－5。
表5－3－5
(2)酸性罐头食品 每罐接种培养基、管数及培养条件见表5－3－6。
表5－3－6
11．微生物培养检验程序及判定
(1)将按表5－3－5或表5－3－6接种的培养基管分别放入规定温度的恒温箱进行培养，每天观察培养生长情况(对照图5－3－3)。
图5－3－3 低酸罐头食品培养检验及判定程序图
对在36℃培养有菌生长的溴甲酚紫肉汤管，观察产酸产气情况，并涂片染色镜检。如果是含杆菌的混合培养物或球菌、酵母菌或霉菌的纯培养物，不再往下检验；如仅有芽孢杆菌则判为嗜温性需氧芽孢杆菌；如仅有杆菌无芽孢则为嗜温性需氧杆菌，如需进一步证实是否是芽孢杆菌，可转接于锰盐营养琼脂平板在36℃培养后再作判定。
对在55℃培养有菌生长的溴甲酚紫肉汤管，观察产酸产气情况，并涂片染色镜检。如有芽孢杆菌，则判为嗜热性需氧芽孢杆菌；如仅有杆菌而无芽孢则判为嗜热性需氧杆菌。如需要进一步证实是否是芽孢杆菌，可转接于锰盐营养琼脂平板，在55℃培养后再作判定。
对在36℃培养有菌生长的庖肉培养基管，涂片染色镜检，如为不含杆菌的混合菌相，不再往下进行；如有杆菌，带或不带芽孢，都要转接于二个血琼脂平板(或卵黄琼脂平板)，在36℃分别进行需氧和厌氧培养。在需氧平板上有芽孢生长，则为嗜温性兼性厌氧芽孢杆菌；在厌氧平板上生长为一般芽孢，则为嗜温性厌氧芽孢杆菌，如为梭状芽孢杆菌，应用庖肉培养基原培养液进行肉毒棱菌及肉毒毒素检验(按GB4789．12)。
对在55℃培养有菌生长的庖肉培养基管，涂片染色镜检。如有芽孢，则为嗜热性厌氧芽孢杆菌或硫化腐败性芽孢杆菌；如无芽孢仅有杆菌，转接于锰盐营养琼脂平板，在55℃厌氧培养，如有芽孢则为嗜热性厌氧芽孢杆菌，如无芽孢则为嗜热性厌氧杆菌。
(2)对有微生物生长的酸性肉汤和麦芽浸膏汤管进行观察，并涂片染色镜检。按所发现的微生物类型判定。
12．罐头密封性检验
对确定有微生物繁殖的样罐均应进行密封性检验以判定该罐是否泄漏，见附录B。
(六)结果判定
(1)该批(锅)罐头食品经审查生产操作记录，属于正常；抽取样品经保温试验未胖听或泄漏；保温后开罐，经感官检查、pH测定或涂片镜检，或接种培养，确证无微生物增殖现象，则为商业无菌。
(2)该批(锅)罐头食品经审查生产操作记录，未发现问题；抽取样品经保温试验有一罐及一罐以上发生胖听或泄漏；或保温后开罐，经感官检查、pH测定或涂片镜检和接种培养，确证有微生物增殖现象，则为非商业无菌。
附录A 数种专用培养基
(补充件)
A1 溴甲酚紫葡萄糖肉汤
A1．1 成分
①蛋白胨：10g。
②牛肉浸膏：3g。
③葡萄糖：10g。
④氯化钠：5g。
⑤溴甲酚紫：0．04g(或1．6%酒精溶液2mL)。
⑥蒸馏水：1000mL。
A1．2 制法
将上述各成分(溴甲酚紫除外)加热搅拌溶解，调至pH7．0±0．2，加入溴甲酚紫，分装于带有小倒置管的中号试管中，每管10mL，121℃灭菌10min。
A2 酸性肉汤
A2．1 成分
①多价蛋白胨：5g。
②酵母浸膏：5g。
③葡萄糖：5g。
④磷酸氢二钾：4g。
⑤蒸馏水：1000mL。
A2．2 制法
将以上各成分加热搅拌溶解，调至pH5．0±0．2，121℃灭菌15min，勿过分加热。
A3 麦芽浸膏汤
A3．1 成分
①麦芽浸膏：15g。
②蒸馏水：1000mL。
A3．2 制法
将麦芽浸膏在蒸馏水中充分溶解，滤纸过滤，调至pH4．7±0．2，分装，121℃灭菌15min。
如无麦芽浸膏，可按下法制备：用饱满健壮大麦粒在温水中浸透，置温暖处发芽，幼芽长达到2cm时，沥干余水，干透，磨细使成麦芽粉。制备培养基时，取麦芽粉30g加水300mL、混匀，在60～70℃浸渍1h，吸出上层水。再同样加水浸渍一次，取上层水，合并两次上层水，并补加水至1000mL，滤纸过滤。调至pH4．7±0．2，分装，121℃灭菌15min。
A4 锰盐营养琼脂
按GB4789．28配制营养琼脂，每1000mL加入硫酸锰水溶液1mL(100mL蒸馏水溶解3．08g硫酸锰)。观察芽孢形成情况，最长不超过10d。
附录B 罐头密封性检验方法
(参考件)
将已洗净的空罐，经35℃烘干，根据各单位的设备条件进行减压或加压试漏。
B1 减压试漏
将烘干的空罐内小心注入清水至八、九成满，将一带橡胶圈的有机玻璃板妥当安放罐头开启端的卷边上，使能保持密封。启动真空汞，关闭放气阀，用手按住盖板，控制抽气，使真空表从0升到6．8×104Pa(510mmHg)的时间在1min以上。并保持此真空度1min以上。倾侧空罐仔细观察罐内底盖卷边及焊缝处有无气泡产生，凡同一部位连续产生气泡，应判断为泄漏，记录漏气的时间和真空度，并在漏气部位做上记号。
B2 加压试漏
用橡皮塞将空罐的开孔塞紧，开动空气压缩机，慢慢开启阀门，使罐内压力逐渐加大，同时将空罐浸没在盛水玻璃缸中，仔细观察罐外底盖卷边及焊缝处有无气泡产生，直至压力升至0．7kg／cm2并保持2min，凡同一部位连续产生气泡，应判断为泄漏，记录漏气的时间和压力，并在漏气部位做上记号。