食品中BHA与BHT的含量测定
出处：按学科分类—工业技术 中国轻工业出版社《食品添加剂分析检验手册》第35页（9412字）
(一)气相色谱法
1．原理
样品中的BHA和BHT用石油醚提取，通过层析柱使BHA与BHT净化，浓缩后，经气相色谱分离后用氢火焰离子化检测器检测，根据样品峰高与标准峰高比较定量。
2．试剂和溶液
2．1 石油醚：沸程30～60℃。
2．2 二氯甲烷。
2．3 二硫化碳。
2．4 无水硫酸钠。
2．5 硅胶 60～80目，于120℃活化4h放干燥器中备用。
2．6 弗罗里硅土 60～80目，于120℃活化4h放干燥器中备用。
2．7 BHA、BHT混合标准贮备液 准确称取BHA、BHT各0．1000g，混合后用二硫化碳溶解，定容至100mL，此溶液分别为每毫升含1．0mgBHA、BHT，置冰箱保存。
2．8 BHA、BHT混合标准使用液 吸取标准储备液4mL于100mL容量瓶中，用二硫化碳定容至100mL，此溶液分别为每毫升含0．040mgBHA、BHT，置冰箱中保存。
3．仪器
3．1 气相色谱仪附FID检测器。
3．2 蒸发器容积200mL。
3．3 振荡器。
3．4 层析柱1×30cm玻璃柱，带活塞。
3．5 气相色谱柱长1．5m，内径3mm玻璃柱，于Gas ChromQ(80～100目)担体上涂10%(m／m)QF－1。
4．样品处理
4．1 试样的制备 采取0．5kg含油脂较多的样品，1kg含油脂少的样品，然后用对角
线取
、
或根据样品情况取有代表性样品，在玻璃乳钵中研碎，混合均匀后放置广口瓶内保存于冰箱中。
4．2 脂肪的提取。
4．2．1 含油脂高的样品(如桃酥等)：称取50．0g，混合均匀，置于250mL具塞锥形瓶中，加50mL石油醚(沸程为30～60℃)，放置过夜，用快速滤纸过滤后，减压回收溶剂，残留脂肪备用。
4．2．2 含油脂中等的样品(如蛋糕、江米条等)：称取100g左右，混合均匀，置于500mL具塞锥形瓶中，加100～200mL石油醚(沸程为30～60℃)，放置过夜，用快速滤纸过滤后，减压回收溶剂，残留脂肪备用。
4．2．3 含油脂少的样品(如面包、饼干等)：称取250～300g，混合均匀后，于500mL具塞锥形瓶中，加入适量石油醚浸泡样品，放置过夜，用快速滤纸过滤后，减压回收溶剂，残留脂肪备用。
5．操作步骤
5．1 试料的制备。
5．1．1 层析柱的制备：于层析柱底部加入少量玻璃棉，少量无水硫酸钠，将硅胶－弗罗里硅土(6+4)共10g，用石油醚湿法混合装柱，柱顶部再加少量无水硫酸钠。
5．1．2 试样制备：称取4．2制备的脂肪0．50～1．00g，用25mL石油醚溶解移入5．1．1的层析柱上，再以100mL二氯甲烷分5次淋洗，合并淋洗液，减压浓缩近干时，用二硫化碳定容至2mL，该溶液为待测溶液。
5．1．3 植物油试料的制备：称取混合均匀样品2．00g，放入50mL烧杯中，加30mL石油醚溶解转移到5．1．1层析柱上，再用10mL石油醚分数次洗涤烧杯，并转移到层析柱，用100mL二氯甲烷分5次淋洗，合并淋洗液，减压浓缩近干，用二硫化碳定容至2mL，该溶液为待测溶液。
5．2 测定 注入气相色谱仪3μL标准使用液，绘制色谱图，分别测量各组分峰高或面积；再注入3μL样品待测溶液(应视样品含量而定)，绘制色谱图，分别测量峰高或面积，并与标准峰高或面积比较计算含量。
6．分析结果的表述
式中 m——待测溶液BHA(或BHT)的质量，mg
hi——注入色谱样品中BHA(或BHT)的峰高或面积
hs——标准使用液中BHA(或BHT)的峰高或面积
Vi——注入色谱样品溶液的体积或面积
Vm——待测样品定容的体积，mL
Vs——注入色谱中标准使用液的体积，mL
ρ，——标准使用液的浓度，mg／mL
式中 x1——食品中以脂肪计BHA(或BHT)的含量，g／kg
m1——待测溶液中BHA(或BHT)的质量，mg
m2——油脂质量(或食品中脂肪的质量)，g
结果的表述：报告平行测定算术平均值的2位小数值。
7．允许差
相对相差(BHA、BHT)≤15%。
8．其他
BHA、BHT气相色谱图如图2－1所示。
图2－1 BHA、BHT气相色谱图
气相色谱参考条件：
色谱柱：长1．5m，内径3mm玻璃柱，10%(m／m)QF－1的Gas Chrom Q(80～100目)
检测器：FID
温度：检测室200℃，进样品200℃，柱温140℃
载气流量：氮气(N2)70mL／min，氢气(H2)50mL／min，空气500mL／min
(二)比色法
1．原理
样品经石油醚提取后，通过硅胶柱层析使BHA与BHT分离。BHA与2，6－二氯醌氯亚胺－硼砂溶液生成一种稳定的蓝色化合物。BHT与α，α′－联吡啶－氯化铁溶液生成橘红色物质，可分别进行比色测定。
2．试剂和溶液
2．1 0．01%2，6－二氯醌氯亚胺乙醇溶液 此液用无水乙醇配制，置冰箱保存，供3天使用。
2．2 硼砂缓冲液 称取硼砂3．1g，氯化钾3．5g，加水溶解后，加入1mol／LNaOH溶液32mL，并以水稀释至2000mL。
2．3 0．2%α，α′－联吡啶溶液 称取α，α′－联吡啶0．2g，加入无水乙醇2mL，使之溶解后加水至100mL。
2．4 0．2%三氯化铁溶液 称取三氯化铁0．2g，加水溶解后稀释至100mL。
2．5 30%乙醇溶液。
2．6 72%乙醇溶液。
2．7 无水乙醇。
2．8 30～60℃石油醚。
2．9 60～100目硅胶(不活化)和氧化铝(层析用)。
2．10 BHA标准溶液 准确称取BHA0．050g，加入少许无水乙醇溶解后，移入100mL棕色容量瓶中，并加无水乙醇定容至刻度。此溶液每毫升含BHA0．5mg，注意避光保存，使用时用无水乙醇稀释为每毫升含BHA0．01mg。
2．11 BHT标准溶液 准确称取BHT0．1g，用无水乙醇溶解后，移入100mL棕色容量瓶中，并用无水乙醇稀释至100mL。此溶液每毫升含BHT1mg，注意避光保存。使用时，用无水乙醇稀释为每毫升含BHT0．01mg。
3．仪器
3．1 硅胶柱。
3．2 分光光度计。
4．测定方法
4．1 BHA标准曲线的绘制 准确吸取每毫升含BHA0．01mg的标准溶液0．0、0．2mL、0．4mL、0．6mL、0．8mL、1．0mL或0．0、1．0mL、2．0mL、3．0mL、4．0mL、5．0mL，分别置于25mL比色管中，加入72%乙醇至总体积为8mL，摇匀，加入0．01%2，6－二氯醌氯亚胺溶液1mL，充分混匀后加入硼砂缓冲溶液1mL，再摇匀后静置20min，于分光光度计在620nm波长下测定吸光度，并绘制标准曲线。
4．2 BHT标准曲线的绘制 准确吸取每毫升含BHT0．01mg的标准溶液0．0、0．2mL、0．4mL、0．6mL、0．8mL、1．0mL或0．0、1．0mL、2．0mL、3．0mL、4．0mL、5．0mL，分别置于25mL比色管中，加入0．2%α，α′－联吡啶1mL，摇匀后，在暗室避光下迅速加入0．2%三氯化铁溶液1mL，摇匀后放置60min，于分光光度计在波长520nm下测定吸光度，并绘制标准曲线。
4．3 样品处理和分离测定 称取经磨碎的样品10g，置于150mL带磨口的三角瓶中，加石油醚50mL，于振荡器上振荡20min，静止，吸取上层清液25mL，通过硅胶柱层(硅胶柱内径为25mm，长250mm，具有玻璃磨口活塞，柱内装13g硅胶，7g氧化铝，并在上下两端加入少量的无水硫酸钠)，以石油醚进行淋洗，弃去50mL初液后，用容量瓶收集石油醚淋洗液100mL，摇匀，取出4mL，于25mL比色管中水浴蒸干，加入30%乙醇溶液8mL，0．2%α，α′－联吡啶1mL，以下操作步骤与标准曲线绘制相同，测定吸光度，从标准曲线查出BHT的含量。
再用无水乙醇洗涤硅胶柱，用容量瓶收集淋洗液50mL，吸取乙醇淋洗液2mL于比色管中，加入72%乙醇至总体积为8mL，加入0．01%2，6－二氯醌氯亚胺溶液1mL，以下操作步骤与标准曲线绘制相同，测定吸光度，从标准曲线查出BHA的含量。
5．分析结果的表述
式中 m——样品质量，g
m1——按曲线查出BHT或BHA的质量，g
K——全部样液为测定时所取样液倍数
(三)薄层层析法
1．原理
选用水蒸气蒸馏法提取食品中BHA和BHT，馏出物用石油醚提取后，经浓缩、薄层层析分离，然后分别解析分离BHA、BHT的斑点，最后，用分光光度计比色定量。
2．试剂和溶液
2．1 无水氯化钙 分析纯。
2．2 石油醚 沸程30～60℃。
2．3 展层溶剂 异辛烷：丙酮(20∶5)。
2．4 显色剂。
2．4．1 磷钼酸：分析纯。
2．4．2 硼砂：分析纯。
2．4．3 二氯醌氯亚胺：分析纯。
2．4．4 邻联二茴香胺：分析纯。
2．4．5 亚硝酸钠：分析纯。
2．5 硅胶G 荧光化学试剂厂出品。
2．6 异辛烷 2，2，4－三甲基戊烷，进口分装。
2．7 丙酮 分析纯。
2．8 36%醋酸或冰醋酸 分析纯。
2．9 氢氧化钠 分析纯。
2．10 α，α′－联吡啶 分析纯。
2．11 三氯化铁 化学纯。
2．12 80%乙醇。
2．13 BHA、BHT标准溶液 精确称取标准BHA、BHT50mg，用80%乙醇配制成100mL，混匀，每毫升含BHA、BHT各500μg，置冰箱内备用。
2．14 显色剂 精确称取α，α′－联吡啶及三氯化铁各0．25g，分别用80%乙醇定容至25mL，制成1%溶液，使用前各取4mL混匀，作喷雾液。
3．仪器
3．1 水蒸气蒸馏装置 见图2－2。
图2－2 水蒸气蒸馏装置
3．1．1 蒸汽发生瓶：1L圆底烧瓶。
3．1．2 蒸馏烧瓶：500mL平底烧瓶。
3．1．3 冷凝管及接收瓶：14#磨口、300mm长的蛇形冷凝器，上口与蒸馏弯头连接，下口与带14#磨口的筒形管连接，管端插入300mL带盖烧杯中，作馏出液接收瓶用，为便于控制馏出液量，在烧杯150mL液面处划一标线。
3．1．4 接触温度计：200℃。
3．1．5 玻璃基板：8cm×15cm。
3．1．6 微量注射器：10μL、50μL、100μL。
3．1．7 层析缸：10cm×9cm×17cm。
3．1．8 涂敷器。
3．1．9 电吹风。
3．1．10 玻璃喷雾器。
3．1．11 粉粒收集管。
3．1．12 分光光度计。
3．1．13 玻璃棉：预先用约2mol／LNaOH溶液浸泡，再用水浸漂洗干净；用2mol／LHCl溶液浸泡，再用自来水漂洗干净；最后用蒸馏水漂洗至中性，烘干备用。
4．操作步骤
4．1 样品制备和提纯 取样品约30g，放于玻璃研钵中充分研细，混匀后，准确称取20g放于蒸馏烧瓶中，加16g无水氯化钙，200mL蒸馏水。开启电源，加热甘油浴，调节温度为140℃，同时将蒸汽发生瓶加热，使瓶内蒸馏水沸腾发生水蒸气，立即装上蒸馏弯头、导汽管等，并开启冷凝水，保持蒸馏烧瓶中的样品缓缓沸腾，蒸馏45min，至馏出液达150mL标记处时，关闭电源及冷却水，立即取出接收瓶。
将馏出液转移到250mL分液漏斗中，振摇数下，倒置分液漏斗，打开活塞放气后，再振摇30s，静置分层后，将下层水液放入另一分液漏斗中，收集上层石油醚，再加20mL石油醚到水层中，振摇约30s，静置分层，将下层水液放入原分液漏斗中。石油醚层合并到第一次石油醚液中去，再加20mL石油醚到分液漏斗的水层中，振摇30s，静置分层，放去下层水液。将3次石油醚抽提液混合在一起，流经20g无水硫酸钠的小漏斗过滤，脱水，并用少量石油醚洗漏斗，滤液一起倒入K、D浓缩器中减压浓缩(温度不超过40℃)至0．5～0．7mL，留待薄层层析用。
4．2 薄层层析定性 用微量注射器吸取样液30μL(根据样液中所含BHA、BHT浓度而增减)点在薄板上，点样线距底边2cm，标准溶液与样品同时点在一块板上。
将薄板放入层析缸(先用相应的溶剂系统饱和)，薄板下端浸入溶剂0．5～1cm，密闭层析缸，在暗室中避光保存，待溶剂前沿升达14cm处时，取出薄板置于通风柜中，自然暗干后，喷洒不同显色剂，根据其比移值(Rf)及标准BHA、BHT出现相同的色斑来定性确证。
喷洒不同显色剂斑点颜色变化如下：
(1)20%磷钼酸：BHT斑点呈蓝色。
(2)20%硼砂，0．1%二氯醌氯亚胺乙醇等量混合液：BHT斑点呈黄色。
(3)0．3%邻联二茴香胺与0．6%亚硝酸钠5∶2混合液：BHT斑点呈黄色。
4．3 测定方法。
4．3．1 制板：称取硅胶G3g于烧杯中，加蒸馏水8mL，搅拌3～7min，使粘稠度适中后涂板，在室温下晾干，105℃活化1h，取出置于干燥器中备用。
4．3．2 点样与显色：用微量注射器吸取浓缩液80μL，点在薄板上，点样线距底边2cm，中间点标样，两边点样品，点距2cm，直径不超过5mm，待斑点晾干后，将板放至预先已取好的展层溶剂中，严密封闭层析缸盖，当展层溶剂前沿升达12cm处时，取出薄板，置于通风柜中晾干，喷洒显色剂(4mL1%α，α′－联吡啶与4mL1%三氯化铁的混合液)间歇喷洒，直至喷完。
4．3．3 解吸与定量：将显色后的薄板，放在干燥器中避光存放5～6h，此时板面黄色基本褪掉，红色斑点明显出现，取出薄板，用粉粒吸集器将BHA、BHT斑点分别收集，加18%醋酸解析，转移入10mL容量瓶中，用20%氢氧化钠溶液调至pH5～6，加18%醋酸定容，离心，取清液置于1cm比色杯中，在520nm波长下测定消化值。另用粉粒吸集器，在同薄板上吸集近乎同样量的吸附剂作空白，以同样条件解吸后作参比液。
4．3．4 标准曲线：在8cm×15cm薄板上点标准BHA、BHT混合液各250μg，点成条状或点状，同上操作，经展层、干燥、显色后，用18%醋酸解吸至25mL容量瓶中，调pH定容(10μg／mL)。吸取0．5mL、1．0mL、2．0mL、3．0mL、4．0mL、5．0mL分别定容至10mL，即得每毫升含BHA、BHT各点微克的标准比色液，然后置1cm比色杯中，在波长520nm下测定吸光度，将各点连成曲线。
5．分析结果的表述
以所得样液吸光度，在标准曲线上查出对应BHA、BHT浓度(μg／mL)，按式(2－9)计算样品中BHA、BHT含量(μg／g)。
式中 ρ1——从标准曲线上查得的BHA、BHT浓度，μg／mL
V1——定容体积，mL
V2——样品减压浓缩后总体积，mL
V3——点样量，mL
m——样品质量，g
x——样品中抗氧化剂的含量，μg／g