叶绿素的测定

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《果树施肥手册》第159页（1139字）

光合作用的实质是叶绿素吸收光能用来氧化水，放出分子氧，并还原二氧化碳为碳水化合物，成为果树主要有机营养的来源。这个反应必须借助叶绿素。叶绿素的主要成分为叶绿素a和b，它们都是卟啉化合物，它不溶于水而只溶于乙醇、丙酮、乙醚、乙烷等有机溶剂。叶绿素a、b的溶液都有两个吸收峰，一个在蓝紫区，一个在红光区。在蓝紫区的高峰里所有卟啉化合物所共有的，只有在红光区的峰是叶绿素所特有的，我们利用这个特点进行叶绿素的测定。

方法原理：用丙酮提取叶绿素，在特定波长下测定其吸收度，然后用公式计算叶绿素a、b和总叶绿素的含量。

试剂：80毫升丙酮加20毫升水，配成80%丙酮溶液。

仪器：分光光度计、真空泵等。

测定方法：

①测定前，将所需容器用磷酸三钠溶液洗涤干净，以除去可能分解叶绿素的微量酸。

②将新鲜的叶子去掉叶脉并剪碎或用打孔器取样，迅速称取1．0克放在研钵中，加入80%的丙酮和少许碳酸钙，研磨成浆状，小心将液体倒在铺有滤纸垫的布氏漏斗中，抽气过滤，再加丙酮数次，直到提取完全。用丙酮洗净研钵和漏斗，将滤液洗入100毫升容量瓶中，用丙酮定容至刻度。

③将叶绿素的浸出液放在1厘米厚的比色杯中，在645、663和652纳米波长下比色，测定吸光度，以80%丙酮为空白对照。如果溶液的颜色太深，可吸出部分滤液，用80%丙酮稀释至一定体积，再进行比色。

结果计算：

式中：D——吸光度；

W——样品鲜重(克)；

V——样品定容体积(毫升)；

V₁——吸出滤液体积(毫升)；

V₂——比色时的定容体积(毫升)。

注意事项：

①叶绿素的浸出液不可久放，应尽快比色。

②叶绿素a和b有一定的比例，约为2～3，如果测得数值不能得到这一比值，说明所用的仪器分光能力不够强。