睫状神经营养因子
出处：按学科分类—医药、卫生 中山大学出版社《脊髓损伤》第576页（8880字）
睫状神经诱向(营养)因子(ciliary neuratrophic or ciliaryneuronotrophic factor，CNTF)是Adler等(1979)由第8天鸡胚(E8)眼分离的一种酸性蛋白，等电点为5．0，分子质量为20kD，其氨基酸序列与NGF等是不同族的。CNTF在眼脉络膜、虹膜和睫状肌有丰富的含量。并且，在发育过程中，其靶组织(如眼)CNTF的含量随胚龄的增长而增高，如鸡E15眼CNTF活性总量约为E12眼的100倍，表明在发生中CNTF具有重要作用。CNTF能够维持培养的睫状节(副交感)神经细胞的存活。对于培养的新生大鼠交感神经细胞，CNTF可增高其胆碱乙酞基转移酶的水平，并降低酪氨酸羟化酶活性，借以诱发胆碱能神经细胞的分化。研究表明，CNTF对鸡E7通过抑制交感神经细胞的分裂来影响其分化。此外，有资料显示，CNTF在体外能促进交感神经元的存活，体内能促进脊髓运动神经元的存活，对于背根节、交感节神经细胞和嗜铬细胞的存活的突起的生长均有支持作用。所以，CNTF既是神经营养性因子，也是神经生长促进因子。
一、CNTF及其基因结构
(一)CNTF的结构
CNTF最初由Helfand等在1976年发现，1984年Barbin等从鸡睫状神经元提取获得，并于1989年获得CNTF的cDNA。人类CNTF(hCNTF)是一个由200个氨基酸残基组成的酸性蛋白质，分子量为20～24kD，仅在第17位有一个Cys，分子内无二硫键，无分泌信号，无N2糖基化位点和信号及肽，能耐受剧烈的化学处理。在CNTF一级结构的基础上预测CNTF的高级结构，认为它和造血细胞因子如白细胞介素－6(IL－6)、白血病抑制因子(LIF)、抑瘤素M(OSM)、粒细胞集落刺激因子(GCSF)及骨髓单核细胞生长因子(MGF)等有相似的螺旋框架结构，故被认为是造血因子超家族的成员之一，即均由A、B、C、D4个α－螺旋束组成分子的骨架结构，称为神经节细胞因子。其中D螺旋中部D－区与亲水的A-B螺旋连接区构成高亲和力的受体结合位点，这种D－螺旋结构的存在对其生物活性十分重要；而C端形成的松散转角和无规则卷曲结构对CNTF的生物活性影响不大；B螺旋结构后段和C螺旋结构可能形成蛋白质的疏水核心。
(二)CNTF基因
人类CNTF(hCNTF)的基因位于第11号染色体长臂近端，属单拷贝基因，编码区长600bp，两个外显子之间有一个1kb左右的内含子，内含子介于第38～39位氨基酸残基对应的密码子之间，转录起始位点(tsp)位于起始密码子上游5bp，在tsp上游45bp存在可与转录因子IID结合的TATA序列，该序列上游91bp存在Jun和Fos家族二聚体结合位点5’－TGAHTCA－3’；终止子后650bp处有两个聚腺苷酸AATAAT序列，这两个AATAAT序列与保守的AATAAT系列不完全相同，产生编码400核苷酸的3’翻译区。有关CNTF基因的其他调控元件目前尚不清楚。人、兔、大鼠CNTF同源性达84%左右，而与神经生长因子(NGF)的同源性却很低，其分子结构和生物学活性也不同于NGF家族的生长因子，如神经营养因子－3(NT－3)、脑源性神经营养因子(BDNF)等。
二、CNTF的组织分布及其细胞内定位
以往很多实验表明CNTF可由Ⅰ型星形胶质细胞、神经膜细胞、成纤维细胞和骨骼肌细胞合成，因而其广泛存在于中枢和外周神经系统。CNTF阳性神经元和胶质细胞在中枢神经系统主要位于大脑皮质、小脑皮质下区和胚胎脊索。体外培养的Ⅰ型星形胶质细胞也可见CNTF表达；用CNTF cDNA探针原位杂交所证实，CNTF mRNA具有特定的区域分布，在胚胎脊索、脑干和后脑的表达明显高于听觉区。Dobrea等采用免疫组织化学方法研究发现，正常大鼠脊髓的白质中存在着CNTF免疫反应复合物，他们还采用CNTF／胶质源性酸性蛋白(GFAP，星形胶质细胞的特异性抗体)双重标记组织化学研究发现了脊髓中的CNTF免疫反应细胞，GFAP免疫反应呈阴性。说明此类细胞并非是星形胶质细胞，推测它们可能是一类少突胶质细胞。CNTF mRNA在脊髓中主要存在于两类细胞，一类是脊髓的感觉和运动神经根中的雪旺氏细胞；另一类则是位于脊髓白质中的少突胶质细胞。综合起来看，CNTF阳性细胞在中枢神经系统主要分布在大脑皮质、嗅球、小脑皮质下区和脊髓白质；在周围神经系统主要存在于有髓神经纤维髓鞘的雪旺氏细胞中。细胞内定位：胶质细胞CNTF阳性免疫反应定位于胞体，而突起呈阴性反应；在神经元主要位于胞核，而胞浆呈阴性反应。但也有报道在神经元胞核、胞浆CNTF阳性免疫反应均呈阴性。在周围神经系统，CNTF主要分布于睫状神经节和雪旺氏细胞的胞体和突起中。
三、CNTF受体(CNTFR)及其分布
(一)CNTFR的结构
CNTFR不同于NGF家族的生长因子受体，其组成和结构特点类似于IL－6受体和LIF受体，分子量52kD，是由3个亚基CNTFR－α、LIFR－β糖蛋白130(gp130)组成的复合体。其中CNTFR的α－亚单位是CNTF特异性结合蛋白，从而决定哪些细胞对CNTF有反应；它不是跨膜蛋白，而是通过糖基－磷脂酰肌醇(GPI)键锚在细胞膜上，与天然杀伤细胞刺激因子的大亚基有很高的同源性；gp130是一个分子量为130kD的糖蛋白，在IL－6家族中作为信号传递体；L IFR－β分子量为190kD，是LIF的结合蛋白，LIFR－β的胞浆部分没有蛋白激酶活性和GTP结合位点，但并行排列的信号传递体gp130和LIFR－β与Jak-Tyk激活有关，故gp130、LIFR－β与信号传导有关。
(二)CNTFR基因
由于CNTFR的α－亚单位是CNTF特异性结合蛋白，hCNTFR－α基因由10个外显子和9个内含子组成，长度至少35bp，位于染色体的9p13位置，第1、2个外显子和第10个外显子含5’、3’非翻译区，第3个外显子编码信号肽序列，第4个外显子编码免疫球蛋白(Ig)样结构域，第5到第8个外显子编码细胞因子样(CRL)结构域，第9个外显子编码疏水的GPI识别序列。
(三)CNTFR的组织分布
CNTFR在神经系统和骨骼肌中广泛存在。在中枢神经系统以小脑CNTFR－α mRNA水平最高，其他依次为后脑、中脑、丘脑、下丘脑、纹状体、海马、皮质和嗅球，且脑脊液中也存在可溶性CNTFR－α。在周围神经系统的交感神经节、副交感神经节也存在CNT-FR。在外周组织中以骨骼肌的CNTFR－α mRNA水平最高，其次为皮肤、肺、肠、肾、肝、脾和胸腺。
四、CNTF的作用机制
CNTF生理作用的发挥是通过与CNTFR结合，而后发生的一系列复杂生理反应过程。Oppenheim RW等研究发现在敲除了LIFR－β或CNTFR－α基因的胚胎小鼠中枢神经系统中运动神经元有明显减少。相反，LIF或CNTF基因的缺失对发育中的运动神经元并没有明显影响。由此可能存在一种机制对CNTFR基因缺失的小鼠胚胎发育期间运动神经元的减少发挥作用。一种可能参与此机制的物质是CNTF-LIF家族成员心肌营养因子－1(CT－1)。CT－1是第一个真正被证明了的对胚胎发育中的运动神经元的存活所必需的肌源性神经营养因子，它在胚胎骨骼肌中有高水平的表达并由肌管分泌产生，对培养中的大、小鼠运动神经元有促进存活的作用。Oppenheim还发现从胚胎14天至生后1周之间，由于CT－1的缺乏致使脊髓和脑干神经核团中运动神经元的死亡数增加。而有趣的是，在生后时随后时期并没有发现运动神经元的死亡数有进一步的增加，并且在缺乏CT－1的年轻成年小鼠中，周围神经的损伤并没有导致脊髓后角运动神经元有明显额外的减少，正如先前在缺失CNTF和LIF基因的小鼠所观察的那样。Nishimune发现在培养的脊髓前角运动神经元中，CNTF相关细胞因子可以诱导Reg－2的表达(Reg－2是一种胚胎发育期依赖于细胞因子并由胚胎运动神经元分泌的分泌型蛋白，也即胰腺炎相关蛋白－1，PAPI－1)。Reg－2对于运动神经元的某些亚群来说本身是以自分泌／旁分泌的形式来分泌神经营养因子，并通过激活PI－3激酶、Akt激酶和NP-kappaB途径发挥对运动神经元的促存活作用。利用Reg－2抗性的腺病毒特异性阻止Reg－2在运动神经元中的表达，从而可废除CNTF对培养中的运动神经元的作用，这提示Reg－2的表达是CNTF促进运动神经元存活途径中所必需的一步。Reg－2在晚期胚胎脊髓中具有独特的表达模式：在运动神经元中，Reg－2的表达逐渐上调并以单个细胞为基础的方式进行表达，提示只有一部分运动神经元暴露在细胞因子之中。因此，Reg－2是运动神经元的神经营养因子，并且它本身也是CNTF促进运动神经元存活途径的必需的细胞因子媒介。在成人神经系统中，颅脑和脊髓运动神经元对CNTF非常敏感，并且在被抗CNTFR抗体(AADH2CNTF)封闭时，酪氨酸激酶(STAT3)磷酸化会被很快终止。与此形成鲜明对比，表达有CNTFR的其他类型神经元的STAT3磷酸化水平却不随着CNTF的处理而增加，甚至在CNTF被高浓度使用时也不会增加。因此，在体内由CNT-FR诱导STAT3的信号转导是受到调控的。目前的资料提示，至少这种调节的某些步骤发生在STAT3酪氨酸磷酸化阶段，结果提示由受体引起的STAT3信号转导的其他形式也许受到相似的调节。在其他研究中，有人报道，CNTF通过GPI与键锚在细胞膜上的CNTFR－α结合而启动传导，进而引起gp130和LIFRβ的聚合，激活gp130上Box－1区Jak激酶的活性，然后引起gp130远端Box－3区的磷酸化，Box－3吸引STAT3的SH－区与之结合，最后STAT3被Jak激酶活化，导致STAT二聚体的形成。STAT3转位到细胞核后，通过结合到DNA上的基因反应元件调控转录。最近研究还发现，CNTF通过其受体介导可致胞体、核内及树突内磷酸化的STAT3明显增加，提示STAT3酪氨酸激酶磷酸化是CNTF发挥作用信号转导关键的一步。Dolcet研究了Jak／STAT、PI－3激酶／Akt和ERK途径的激活。CNTF在短时间内激活了STAT3和ERK途径，而没有激活PI－3激酶途径。Jak－3抑制剂可以抑制细胞因子和靶肌肉介导的促存活作用。相反，一种ERK抑制剂PD98509却不能抑制细胞因子介导的促存活作用。由此说明ERK与此途径无关。但是PI－3激酶抑制剂L294002也能阻止细胞因子介导的促存活作用。与对照培养组相比较，随着细胞因子处理时间的延长，在后阶段PI－3激酶的活性开始激活，这种延迟增强的活性完全能被Jak－3抑制剂所阻止。综合之，CNTF促进运动神经元存活的细胞内途径是通过PI－3激酶的激活而实现的。而PI－3激酶的激活必须有依赖于Jak途径合成的蛋白质的参与。综上所述，CNTF生理作用的发挥有赖于与CNTFR的结合，从而使STAT3磷酸化继而发挥作用。在这个过程中必须有CT－1和CNTF相关因子分泌的Reg－2的参与，而且Reg－2是CNTF促进运动神经元存活途径中所必需的一步。STAT3酪氨酸激酶磷酸化是CNTF信号转导关键的一步。
五、CNTF的生物学效应
(一)维持神经元存活
CNTF最突出的功能是促进中枢和周围运动神经元的存活，防止受损神经元退变，以及对运动神经元功能的维持，这在基底前脑胆碱能、黑质多巴胺能、丘脑前腹、背侧核以及面神经核和脊髓运动神经元均已得到证明。对培养的鸡胚运动神经元，CNTF是最有效的神经营养因子。经毒物处理可致培养中的脊髓运动神经元死亡，而应用CNTF对损伤的脊髓神经元存活有明显的营救作用。通过基因重组造成CNTF基因缺陷，虽在胚胎发育时期对运动神经元发育影响不明显，但随着年龄的增长，日渐显出CNTF对维持神经元存活的重要性。说明CNTF虽与运动神经元的发育无关，却对出生后运动神经元功能的维持，防止运动神经元退行性丧失有着重要作用。外周神经切断可引起相应脊髓皮质运动神经元(Cortispinal motorneuron，CSMN)死亡，应用CNTF、NT4、GDNF能支持部分脊髓皮质运动神经元存活。CNTF和GDNF可维持被纯化的CSMN存活至少5天；而NT4则对纯化的SCMN作用不明显，但对未纯化的CSMN有作用，表明CNTF和GDNF可直接对CSMN发挥营养作用，而NT4作用的发挥则需辅助细胞参与。此外，CNTF还可阻止体内神经元的退行性丧失和新生小鼠面神经元由于轴突横断而引起的退行性变。遗传型进行性运动神经元疾病(progressive motorneuronopathy，pmn)突变鼠在植入可产生CNTF的细胞后，面神经核神经元的存活数增加，膈神经轴突数增多，运动功能得到改善，小鼠存活时间也显着延长。pmn鼠由于运动神经元退行性病变，在生后6周，40%面神经运动神经元已发生退变，如在生后第4周切断面神经，使其雪旺氏细胞中的CNTF得以释放，则面神经损伤侧的运动神经元存活数显着增加，表明内源性CNTF能阻止体内神经元的退行性变。新生大鼠脊髓运动神经元胞体对轴突损伤反应敏感，容易导致胞体变性、死亡，但生后3周这种易感性明显减弱，可能与此时雪旺氏细胞CNTF mRNA蛋白质水平较高有关。利用同源重组技术修饰CNTF基因(基因打靶技术)使其失活，可导致动物先天性运动神经元变性、死亡；此外，近年还发现CNTF能促进运动神经元轴突再生。
(二)诱导神经元分化
在体研究发现CNTF能诱导胚胎神经元的发育、分化。CNTF不仅可阻止交感神经细胞的增殖并促进其分化，而且它还是交感神经元的胆碱能分化因子，如CNTF能通过提高胆碱转乙酰酶(CHAT)而降低酪氨酸羟化酶(TH)的水平，将肾上腺能神经元转变为胆碱能神经元。
(三)对胶质细胞的作用
大鼠0－2A胶质前体细胞既可以分化为少突胶质细胞也可以分化为星形胶质细胞。CNTF能诱导体外培养的0－2A胶质前体细胞向Ⅱ型星形胶质细胞分化。进一步研究表明，CNTF可以由Ⅰ型星形胶质细胞产生，这种细胞由于受损或受某种因素影响释放CNTF，从而和其他因子共同作用来诱导0－2A前体细胞分化为Ⅱ型星形胶质细胞(Lillien等，1990)。在体外，CNTF能够促进少突胶质细胞的存活，但也需要和其他因子的联合作用。此外，CNTF能保护少突胶质细胞免受肿瘤坏死因子－α和肿瘤坏化因子－β(TNF－α、β)的杀伤。在体内，由于脑内CNTF广泛分布，而且主要存在于胶质细胞中，所以CNTF很可能还作为胶质细胞的保护因子。这一结果为临床研究、治疗胶质细胞病变提供了新思路。
(四)CNTF与神经再生
周围神经雪旺氏细胞含有较多的CNTF和CNTF mRNA。神经损伤后远侧段神经雪旺氏细胞中的CNTF和CNTF mRNA明显减少，至伤后2周几乎观测不到。当坐骨神经损伤后，CNTF在雪旺细胞中的表达量与神经的功能状况同步。用硅胶管桥接，并于硅胶管中加入CNTF，术后每天皮下注射CNTF。结果表明，CNTF能促使更多的运动神经元轴突再生，通过修复部位到达腓总神经中，此类神经元的数量于术后4周时已相当于外膜缝合后9周时的数量，而对感觉神经元轴突再生的作用不明显。当发生华勒变性脱髓鞘化时，CNTF的表达降低；当神经再生而再脱髓鞘化时，CNTF的表达恢复正常，至伤后4周随神经再生成功，CNTF的表达逐渐恢复至正常水平。外周神经损伤后，肌中CNTF受体的表达将增加数十倍，可溶性的CNTFR－α与CNTF形成的复合物也增多，从而有利于神经损伤的修复，若此时在靶肌肉注射CNTF可明显促进周围神经再生和神经功能恢复。随着再生神经纤维增多，CNTF表达也增多，提示雪旺氏细胞表达CNTF与轴突生长及神经再生程度有关，此时若补充外源性CNTF可能会改善神经再生的微环境。
(五)影响非神经组织
CNTF属于细胞因子大家族的成员，因此它对非神经组织生理、病理过程有调节作用。下述两种现象表明，CNTF可能是神经元性肌营养因子：①CNTF在周围神经中有丰富表达；②CNTFR－α、gp130、LIFR－β在骨骼肌中表达丰富。此外，CNTF促进运动神经元轴突在正常肌肉中分支发芽。在体内，在去神经去血管引起肌损伤的情况下，应用CNTF能直接作用于肌原细胞，加速肌管分化形成，增加再生肌纤维的数量，促进肌再生。神经损伤后，其支配的骨骼肌萎缩，CNTFR－α mRNA表达增高20～50倍。而应用CNTF后，可减少神经损伤后引起的肌总蛋白的丢失以及肌肉湿重的降低；且肌痉挛张力及强直张力较对照组高。动物整体肌活动能力与周围神经中CNTF含量呈正相关。而给老年鼠应用CNTF治疗后，肌张力明显增强，肌纤维横断面面积增大。体外实验证实，CNTF能够微弱抑制外周血单核细胞产生IL－8和前列腺素E2，加入CNTFR－α后CNTF的这种抑制作用大大加强。此外，CNTF能抑制胚胎多能干细胞的分化；可在急性炎症反应中诱导肝细胞表达急性期反应蛋白(APP)；皮下注射CNTF可预防失神经支配的肌发生萎缩。近来发现CNTF可诱导大鼠胶质瘤C6细胞的β淀粉样前体蛋白水平增高。将CNTF注入大鼠皮下或腹腔，7～10天后可使其发生恶病质。Gupta等发现CNTF可刺激小鼠胚胎癌P19细胞发生分化，诱导轴突形成，使神经丝合成增加。它也可刺激小鼠神经母细胞瘤细胞轴突生长，使人神经母细胞瘤细胞的胆碱乙酰转移酶活性增高，从而促进瘤细胞的分化。近年还发现CNTF与其他生长因子合作有协同营养作用。目前，已知神经营养因子与神经元的关系并非一一对应。一方面，一种神经营养因子可作用多种神经元；另一方面，一种神经元接受多种营养因子的营养、调节，而且神经营养因子之间存在协同作用。例如，在培养的运动神经元基质中加入BDNF或CNTF均能分别使胞内CHAT水平升高，而联合应用则更加明显；进一步研究发现：单独应用BDNF或CNTF均不能阻止Wobbler突变鼠神经肌肉的进行性退化，但两种因子联合应用却能阻止其发病。
六、CNTF的临床应用与前景
CNTF是神经源性的营养因子，CNTF及其受体广泛存在于神经系统中，对多种神经元具有营养作用，包括脊髓运动神经元、交感神经元、副交感神经元、感觉神经元、海马神经元等，是目前发现的惟一同时具有神经营养作用和肌肉营养作用的因子。又由于CNTF有明显促进中枢和周围运动神经元存活，防止受损神经元退变的功能，由此，它可能对人类运动神经疾病、神经损伤及肌肉萎缩等治疗上发挥重要作用。目前主要将其应用于治疗运动神经元疾病如肌萎缩侧索硬化(ALS)。其方法是通过基因转导技术将CNTF的cDNA转入需治疗的神经细胞或肌肉细胞中，使其表达活性的CNTF，达到治疗的目的。这种方法可避免全身用药的副作用，故对神经系统及肌肉系统疾病的治疗具有广阔的应用前景。另外，CNTF对帕金森氏症的治疗已进入Ⅱ期临床。尽管存在副作用，但是通过改变剂量，改变给药途径以及与其他细胞因子联合使用(如BDNF)可以达到治疗效果。不过，在CNTF作为药物广泛应用之前，还需要解决以下问题：首先，CNTF天然来源少，不易大量获得，因此用重组DNA技术来获取大量活性hCNTF已经成为当务之急。其次，CNTF的给药途径需要改善，对于外周神经系统疾病和脊髓疾病，皮下给药、脊髓腔给药可能达到治疗需要；但对于中枢神经系统疾患，还需要设计灵巧方便的给药途径装置，如在中枢疾患处植入可以稳定表达分泌CNTF的细胞也是一种良好方法。最后是关于CNTF作为药物的安全性问题，虽然动物实验表明，CNTF不会导致任何行为异常，但积极而慎重的基础药理学实验和临床药理学研究是必需的。深入开展CNTF结构、受体、功能研究，将为CNTF用来治疗神经系统疾病提供可靠的依据和基础。