试管苗繁育体系
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《果树育苗手册》第31页（4794字）
离体快繁是农业生物技术的重要组成之一，在农业生产上应用广泛。它具有繁殖速度快，占用空间小等突出优点。通常一年内可以繁殖数以万计的、较为整齐一致的种苗，大大提高繁殖系数。对于难繁殖的园艺植物的名贵品种、优良的单株或新育品种的繁殖推广具有重要的意义。离体繁殖园艺植物的良种种苗，最早在兰花上获得成功。20世纪70年代中期美国商用实验室采用离体繁殖法大规模繁育苹果砧木M27和李砧木Pixy的试管苗，大大促进了这些优良砧木的推广应用。意大利的离体繁殖主要生产桃、柑橘等果树砧木试管苗。日本对花卉、果树、草种及药用植物的离体繁殖已成为重要的育苗手段。我国园艺植物离体快繁育苗的研究与开发起步较晚，但近年来也有较大的发展。目前已建成香蕉、柑橘、葡萄、苹果、草莓、猕猴桃、枇杷、罗汉果、马铃薯、西瓜、兰花、杜鹃、水仙、月季、百合、菊花等数十种园艺植物离体繁殖的生产技术程序，全国各地有数百个各种类型的园艺植物试管苗生产线。
无性系离体繁殖的技术，通常分3个步骤，即无菌材料的建立，试管苗的增殖和生根移苗。
1．无菌材料的建立
(1)材料的选取 作为良种繁殖的材料，必须准确选取优良的母株，即种源可靠、性状稳定、生长健壮、成年的母株，切忌用实生苗繁殖良种。对单子叶的香蕉、菠萝等要从优良母株上选取吸芽，建立无菌株系。不宜采用香蕉子房或花序轴切片繁殖，菠萝冠芽繁殖通常变异比较大，一旦出现变异其繁殖后代变异系数亦将成几何级数增加。因此，对果树植物的繁殖，选取良种母株尤为重要。
(2)材料的灭菌 一般的材料消毒灭菌，在前面已介绍。在良种繁育中材料消毒技术，要求更加严密，因为有些良种材料极少，仅一个芽或一个枝条。一般应首先去除带菌鳞片，枝叶，用肥皂水冲洗干净，再进行材料表面消毒；或者采用水培在干净的环境中生长，待萌发新的芽体或用传统方法预先繁殖后，取繁殖体进行人工消毒灭菌。对难消毒的材料在消毒剂处理之后，用清水冲洗，再用低浓度次氯酸钠冲洗一次立即接种，或待接种后抽生新芽，去除污染部分，取新芽重新消毒接种。对于某些成年材料，用上述处理仍然无效，可能微生物已渗入组织，则需要使用抗菌素或内吸杀菌剂进行消毒。
(3)防止褐变 有的材料很易褐变，甚至接种后会使培养基变褐，严重影响外植体的生长、分化，成为组织培养中一大障碍。褐变是由于组织中的多酚氧化酶被激活，使细胞的代谢发生变化，酚类物质被氧化后产生醌类物质。这类物质呈棕褐色，它们会逐渐扩散到培养基中，抑制其他酶的活性，毒害培养的外植体材料。要防止褐变的发生，选择适当的外植体和培养条件是最主要的手段。外植体应有较强的分生能力，在最适宜的培养条件下，使外植体处于旺盛的生长状态，便可大大减轻褐变。选择适宜的无机盐成分、糖浓度和激素水平也是十分重要的。在培养基中加入抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、半胱氨酸等抗氧化剂，或用抗氧化剂进行材料的预处理或预培养，可预防醌类物质的形成。0．1%～0．5%活性炭对吸附酚类物质效果明显。还可以对易褐变的材料进行连续转移，排除外植体分泌物，以减轻醌类物质对外植体的毒害作用。此外，实践表明，这类带有酚类物质的植物，不同季节其分泌物含量不一，较幼嫩的材料分泌物含量相对较少。因此，可以在分泌物含量少的时期或部位取材，以减少酚类物质的影响。
(4)培养基 建立无菌材料通常可以用简单培养基，特别对于难以消毒灭菌或者酚类物质含量多的外植体，原则上首先获得无菌材料，再进行正常的启动培养。一般建立无菌株系多采用MS或White培养基，并附加低浓度的生长素或细胞分裂素，诱导无菌材料建立繁殖系，经过继代培养，扩大繁殖材料。
2．试管苗的增殖 通过外植体消毒得到无菌材料并进行初代培养，能否不断增殖并进行继代培养，既是组织培养能否成功的关键，也是离体快繁第二阶段的目的。增殖的结果要求提供大量的遗传稳定、整齐一致的试管苗。为实现这一目标，需要从以下几个因素进行研究和讨论。
(1)增殖的方式 主要有3种途径，即腋芽萌发、丛生芽增殖和胚胎发生型。对于不同植物材料，可根据上述增殖方式的特点，选择最有效的繁殖途径。通常采用腋芽萌发，或产生丛芽，再以芽繁殖芽的方法进行继代繁殖。
统计试管苗的增殖速度，大多以芽和苗作单位。试管苗理论上一年能繁殖多少，可用下面的简单公式计算：M=axn
式中：M为年繁殖总数，a为试管苗数，x为每个培养周期增殖的倍数，n为全年可增殖的周期数。
在快繁实践中往往会受到多种因素的限制，实际繁殖值往往远比理论值低。
(2)提高繁殖速度的方法 试管苗的繁殖途径不同，在试管内又受到基因型、外植体来源、年龄、部位、培养基种类、附加成分和培养环境等多种因素的影响，应通过具体试验来摸索每种植物最快最好的繁殖方法。
①改进培养基 基本培养基的种类，无机盐及有机成分，糖浓度，琼脂，特别是激素的种类和浓度都影响到试管苗的分化和增殖。具体进行时一方面可参考已有资料或相近类群的已有结果，另一方面也要进行多次试验找出最佳培养基。
植物生长调节物质，在试管苗增殖中起决定性作用，由于植物体内源激素难以测定。因此，外加是否合适，全凭试验来确定。促进腋芽形成和生长应附加0．1～10．0毫克／升细胞分裂素，偶然也用较高浓度。应用最多的是6－苄基腺嘌呤(BA)，其次是激动素KT(6－糠基腺嘌呤)和2－异戊烯基腺嘌呤(2ip)。玉米素(ZT)由于价格昂贵而应用较少。除细胞分裂素外，培养基中还经常加入低浓度的生长素，以促进腋芽的生长，但要防止愈伤组织化。常用生长素有萘乙酸、吲哚丁酸、吲哚乙酸，浓度在0．1～1．0毫克／升。另外，有时还附加低浓度的赤霉素，以促进腋芽的伸长。
诱导外植体形成不定芽时，一般使用细胞分裂素浓度高于生长素浓度的配比，但也常用细胞分裂素和生长素浓度的比值接近于1的配比。具体应用时应查阅资料，并通过大量筛选来寻找最适当的细胞分裂素和生长素种类和浓度的配比。
试管苗增殖均用蔗糖，浓度为2%～5%，其他附加成分有水解乳蛋白(LH)300～500毫克／升，水解酪蛋白(CH)，以及腺嘌呤等。
②改善培养条件试管苗增殖与培养条件如温度、光照、湿度、培养器皿和培养基的pH密切相关，需要进行控制，以促进繁殖。
温度：不同植物增殖的最适温度不同，大多采用25±2℃的温度。一般低于15℃培养物生长出现停顿，高于35℃时对生长也不利。增殖苗的温度一般是恒温。温度预处理也对试管苗增殖有影响。高温处理不仅可获得无病毒植株，也影响到器官发生。草莓茎尖分生组织经38℃处理3～5天，提高了无病毒茎尖分生组织的成活率。
光照：光对试管苗的生长增殖也有明显影响，表现在光强、光质、光周期等方面。最常用的光周期是16小时光照、8小时黑暗。对于喜光植物可能不仅要延长光照时间，而且要注意加强光照强度。
湿度：培养容器内的相对湿度几乎可达100%，而环境中的湿度会影响培养基湿度，培养室湿度太低，培养基易失水、干裂，影响生长，过高则易引起棉塞长霉，造成污染。一般要求70%～80%的相对湿度，过低应洒水，过高应通风除湿。
培养基的pH：试管苗的增殖要求一定的pH。如果pH不适，则直接影响试管苗对营养物质的吸收，从而影响到生长和繁殖。除特殊要求外，一般培养基pH在5．6～6．0之间。
(3)试管苗继代方法将试管苗进行分株、分割、剪截(剪成单芽茎段)等转接于新鲜培养基上，其容器可以与原来相同，也可用容量更大的三角瓶、罐头瓶、大扁瓶等以尽快扩大繁殖。
在试管苗继代过程中，芽的来源、生长调节剂的用量以及继代的次数均会影响试管苗的变异，而且变异随着继代次数呈几何级数增加。因此，在继代增殖中要确切掌握生长调节剂用量，注意控制继代次数的上限，注意排除愈伤组织形成的芽，选用正常发育的试管苗增殖，淘汰生长弱小的畸形苗。
离体繁殖中有时会出现玻璃化苗，叶片肿胀，质地半透明，叶片畸形生长，最终导致苗丛死亡。引起玻璃苗的原因比较复杂，可以通过几种途径进行控制：一是高琼脂的浓度；二是降低细胞分裂素浓度；三是培养基中附加低浓度多效唑(PP333)。但这种玻璃苗即使得到纠正，为防止其变异，亦不宜继续作为增殖材料。
3．试管苗的生根 离体繁殖产生大量的芽、嫩梢(部分可直接生根成苗)，需进一步诱导生根，才能得到完整的植株，这属于试管苗繁育体系的第三个阶段，其后栽入土中。试验表明影响生根的有如下若干因素：
(1)基本培养基 大多数使用低浓度的MS培养基，一般用1／2MS或1／4MS培养基的大量元素。糖一般使用蔗糖，其浓度多数采用低浓度一般在1%～3%之间。
植物激素 通常不用细胞分裂素，添加低浓度的生长素。一般认为IBA或NAA0．1～0．5毫克／升有利于生根。但不同园艺植物生根的合适生长调节剂，需要进一步通过试验来确定。
(2)其他附加物 有材料报道培养基中加入活性炭或间苯三酚可能对某些植物生根有利；或降低琼脂浓度，减少用量以促进试管苗生根。
4．试管苗移栽 离体繁殖的试管苗能否大量应用于生产，是否有效益，取决于最后一关，即试管苗能否有高的移栽成活率。试管苗的移栽是从“异养”到“自养”的转变，需要有一个逐步适应的过程。因此，移植之前试管苗必须提高光强进行炼苗，让植株生长粗壮，增强小苗体质以提高移栽成活率。同时进一步将瓶口包扎物打开进行炼苗，使试管苗慢慢适应外界环境。
试管苗移植时，首先必须把附着于小苗根部的培养基冲洗干净，以免招致细菌繁殖污染，导致小苗感染腐烂死亡；同时要避免根颈部损伤，引起小苗溃烂。移苗的土壤一般采用人工调配的混合土壤，通常用泥炭土、珍珠岩、蛭石、砻糠灰等，按不同比例混合调配，以利小苗生长。温度湿度的调控对移植的小苗十分重要。试管苗一直是生长在高湿度的培养瓶内，一旦移植于田间，空气湿度降低，小苗容易干枯，因此要采用微雾喷雾增加空气湿度。土壤的湿度不宜太大，土壤水分过多则通气不良，影响长根，易导致烂苗致死。