丙型肝炎的病原学和特异性诊断

出处:按学科分类—医药、卫生 军事医学科学出版社《病毒性肝炎防治手册》第15页(2775字)

一、生物学性状

1989年Choo等证实经血液传播的非甲非乙型肝炎的病原体为丙型肝炎病毒(HCV),并克隆出其全部核苷酸序列。

目前认为HCV为单链线形RNA病毒,直径约为36~62nm,其归类倾向于黄病毒属(Flavivirus)。依据为:①将HCV编码的多肽序列与蛋白数据库用计算机进行比较,显示HCV多肽的一个小区域与黄病毒、植物Potyvirus和动物瘟病毒所编码的、能与三磷酸核苷相结合的螺旋酶有很大的序列同源性,其中与后者的同源性更大。②黄病毒、瘟病毒及植物病毒所编码的丝氨酸蛋白酶和依赖RNA的RNA聚合酶与HCV所编码多肽的某些区域在氨基酸序列上存在一定的相似性。③HCV、黄病毒和瘟病毒中多肽序列相似的一些区域呈共线性,说明这三种病毒有相似的基因结构。④尽管这三种病毒在初级序列上一致性很少,但它们所编码多肽的基本结构及其疏水性相似。这些病毒多肽的氨基端都含有一个基本的核包膜蛋白区,紧接着的是糖蛋白区。⑤HCV基因组5′端区与瘟病毒对应区的核苷酸序列同源性较高。⑥在原始的多肽序列水平上,HCV与瘟病毒也存在着较大的同源性。

HCV对氯仿敏感,可被1∶1000甲醛(37℃,96h)、加热100℃5min,或60℃1h和20%次氯酸溶液灭活。

HCV基因组可分为编码区和非编码区两部分。编码区总长9416个核苷酸,有一个大编码区(ORF)能编码3014个氨基酸的多肽链。病毒基因的编码区又分结构域和非结构域,结构域包括C区和E1/E2区,分别编码病毒的核心蛋白和外膜蛋白,即病毒的结构蛋白。非结构域可分NS1、NS2、NS3、NS4和NS55个区,分别编码各区的非结构蛋白。结构域和非结构域编码的蛋白构成不同的病毒抗原。C-100是由NS3和NS4区基因编码的抗原。目前用做检测抗-HCV的病毒抗原,如CP99、CP20、CP22是由C区基因编码的抗原。C33是NS3区基因编码的抗原。非编码区有5′非编码区和3′非编码区,分别长304个核苷酸和42个核苷酸,它们可能在HCV基因的复制中起重要作用。在3′非编码区的尾端,连有12个U残基。

基因的变异:HCV基因很容易发生变异。根据对不同HCV毒株的核苷酸及氨基酸的同源性分析,5′非编码区最保守,核苷酸同源性为92.5%~97.7%。结构域中C区较保守,核苷酸和氨基酸的同源性分别为81.2%~89.9%和90.6%~96.9%。E1/E2区变异较大,核苷酸和氨基酸的同源性分别为55.7%~74.0%和52.6%~77.6%。非结构域基因也易发生变异,一般其同源性分别为72%~79%和76%~91%。3′非编码区基因变异最大,核苷酸同源性为25.6%~82.1%。根据对不同国家分离的HCV毒株的分析,其中对中国、日本、朝鲜的HCV毒株测序,发现同源性很高。而上述国家分离的HCV与美国分离的HCV毒株比较,基因异源性很高。因此,HCV可能存在不同的亚型。由于不同亚型存在抗原性差异,因此应用不同国家生产的抗原试剂检测抗-HCV的阳性率,必然会出现较大的差异。所以最好用本国自产的抗原试剂,可以提高抗HCV的阳性率。同时,用PCR法检测HCVRNA,亦应选择HCV基因保守区的核苷酸序列作为特异性引物,可以提高HCV-RNA的阳性率。

二、特异性诊断

(一)抗-HCV检测

抗-HCV是HCV感染后产生的特异性抗体,是HCV感染的标志。抗-HCV阳性标志着正在感染HCV或既往感染过HCV。但多数情况下认为抗-HCV阳性是体内存在HCV,反映有传染性。HCV基因组编码区有结构区基因和非结构区基因两部分,均可分别产生结构区抗原蛋白和非结构区抗原蛋白,分别检测相应的抗-HCV。最早应用于检测抗-HCV的抗原是C-100抗原,以后又用C-33抗原,均为HCV的非结构区抗原蛋白。用ELISA检测抗C-100有以下缺点:①抗体出现晚,约半数输血后丙型肝炎患者于输血后4~6个月抗体才首次阳转,因此,不宜作为急性丙型肝炎的常规实验室检查;②抗C-100不是中和抗体,也不是IgM抗体,而是IgG抗体;③本法不够灵敏,少数丙型肝炎患者检测不到抗C-100;④有非特异性,一些自身免疫性慢性肝病患者可出现假阳性,因此,抗-HCV阳性需作蛋白印迹试验(RIBA)证实。

由于HCV核心抗体出现较早,近年来,用合成的核心抗原如C9、CP10及C-22等检测抗-HCV,提高早期检出率。美国试制了第二代ELISA抗-HCV试剂盒。该试剂盒用HCV结构区核心抗原(C-22)和非结构区抗原(C-33及C-100),检测抗-HCV。因为人感染HCV后,一般抗C-33最早出现,其次是抗C22,抗C-100出现最晚。应用该试剂盒检出抗-HCV的时间较第一代试剂盒提早16~42d。抗-HCV的检出率提高25%~30%。

(二)HCV-RNA检测

从患者血和肝脏中均可检出HCV-RNA,说明体内存在HCV,是病毒复制及传染性的直接指标。HCV-RNA在感染HCV1~2周后,即可从患者血清中检出,因此,可用于早期诊断。血清中HCV-RNA持续或间歇阳性,提示为慢性丙型肝炎。和抗HCV同时检测,可以鉴别为活动性感染还是既往感染。如抗HCV和HCV-RNA均为阳性或HCV-RNA阳性和抗-HCV阴性,均为活动性感染;如抗-HCV阳性而HCVRNA阴性则为既往感染。检测HCV-RNA采用PCR法。由于该法十分敏感,如在操作过程中,有少量HCV-RNA污染,很容易出现假阳性,因此,应注意无菌操作,切忌外源性污染。

检测抗-HCV和HCV-RNA的临床意义,除可以特异性地诊断HCV感染外,还可筛选献血者,也可作为丙型肝炎的疗效考核标准及预测丙型肝炎预后。

(三)HCV抗原检测

用免疫组化法检测肝组织中HCV抗原,从感染HCV的黑猩猩或患者血清中提取IgG,用异硫氰酸荧光素标记后作为探针,检测肝内HCV抗原。用参与血清、阻断试验和吸附试验证明,本法为丙型肝炎所特异。

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