沉淀反应
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第132页（10249字）
可溶性抗原与相应抗体在溶液中结合，形成肉眼可见的沉淀，称为沉淀反应。沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等。如细菌的内毒素、外毒素、菌体裂解物，病毒(小型)悬液和病毒的可溶性抗原，血清，组织浸出液等。经典的沉淀反应有环状试验和絮状试验两种。以后与琼脂扩散、琼脂电泳等技术结合，相继建立了免疫电泳、对流电泳、火箭电泳、交叉电泳等技术；与放射自显影相结合又建立了放射火箭电泳、免疫沉淀等技术，大大提高了敏感性和对复合抗原的分析能力，使沉淀反应得到了越来越广泛的应用。
一、环状沉淀试验
环状沉淀试验是快速测定溶液中的可溶性抗原或抗体的方法。将可溶性抗原叠加于置于细玻璃管中的抗体表面，在抗原抗体相接触的界面可出现环状沉淀带。该法以其简单和快速而得到广泛的应用。如用于炭疽病诊断的Ascoli试验、链球菌血清型鉴定、血迹鉴定和沉淀素的效价测定等。其中炭疽沉淀血清和抗原均有商品出售。
(一)试验方法
1．取5支小试管(5×50mm)置于小试管架上，第1、2管内加抗血清，3、4管内加正常血清，第5管内加抗原，分别用毛细滴管加至4～5mm高。
2．将1、4、5管上轻轻叠加等量缓冲液，2、3管上轻轻叠加等量待检抗原。为防止上下两界面破坏，可将小试管取出试管架，微倾斜，沿管壁加入抗原或缓冲液。
3．几分钟后观察结果，第2管出现白色环状沉淀带，其余管无此种沉淀带判为阳性。
4．用于沉淀素效价滴定时，需将抗原作100×、1000×、2000×、4000×、8000×、16000×等稀释，分别叠加于抗血清上，出现环状沉淀的最大稀释倍数，即该血清的沉淀素效价。
(二)注意事项 反应液必须十分澄清，以免影响结果的观察。可用60000g离心30min使反应物澄清。除去类脂则需在0℃下25000g离心30min，此时类脂呈固态浮于表面，将离心管置冰浴，用预冷的吸管或注射器插入并吸出底层的清朗液体即可。
二、絮状沉淀试验
抗原与抗血清在试管内混合，在有电解质存在时，抗原抗体复合物可形成混浊沉淀或絮状凝聚物。此法通常用于毒素和抗毒素的滴定，具体方法详见毒素的测定。
三、琼脂免疫扩散试验
利用抗原抗体能在琼脂凝胶中自由扩散，二者在琼脂中结合，在最适比例处出现沉淀带。与液相沉淀反应相比本法的最大优点是可使复合的各抗原抗体系统根据自己的浓度、扩散系数、最适比等因素形成各自的沉淀带，因而可用于抗原组分的分析和定量测定。琼脂扩散分为单向单扩散，单向双扩散，双向单扩散和双向双扩散四种类型，其中双向单扩散和双向双扩散应用最广。前者用于抗原或抗体的定量测定，后者用于抗原的比较和鉴定，也可用于抗原或抗体的检测。
(一)双向双扩散 双向双扩散即Ouchterlong法，由Ouchterlong和Elek于1948年建立，简称双扩散。当抗原和抗体在琼脂中相互扩散时，各自产生一个扩大的圆环，2个圆环相遇时，如果抗原抗体呈特异性结合且比例适当，就呈现一条不透明的白色沉淀带，否则无沉淀带出现。在复合抗原中视所含抗原的化学结构、分子量、带电情况等不同，扩散速度也就不同，与相应抗体结合的最适比也不一样，而且这种沉淀带一旦形成就是一道“特异性的屏障”，能阻止相同的抗原抗体继续扩散，但仍允许不同的抗原抗体继续扩散，因此每一种抗原组分均可形成各自的沉淀带。本法可用于分析抗原成分，比较抗原的异同和微小的差异。本法在病毒病诊断和检疫中应用很广，如马传贫、牛白血病、鸡马立克病等。所用试剂均有商品出售。
1．试验步骤
(1)取洁净的小平皿放在水平台上，用含0．01%硫柳汞的生理盐水配制1%琼脂，在水浴锅上加热溶化，倒入平皿中约3mm厚。
(2)将图9-1的七孔图案(孔径0．5cm，孔距0．7cm)置琼脂板下，用打孔器打孔(亦可按试验要求打成其他图形)，以针尖将孔内琼脂挑出，并向孔底补垫一小滴琼脂，以免孔底有渗漏。
(3)视试验目的和要求不同设计加样方案。用毛细滴管或微量进样器加样，加满为止，不可溢出。
(4)将琼脂板水平放于一密闭、潮湿的容器中(如有湿纱布的饭盒中)，室温扩散每天观察1～2次至出现肉眼可见的白色沉淀带为止。扩散结果可用照像法记录，亦可染色后保存。
2．结果分析
3．结果判定
(1)用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中心孔，待检抗原和需比较的抗原置周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原；若二者有部分相连，并有叉角，表明二者有共同抗原决定簇，若二条沉淀带互相交叉，说明二者完全不同，见图9-1。
图9-1 琼脂双扩散试验
中心孔含a．b．c三种抗体
AB和AC为不同型的抗原(呈双线或交叉)B、C为同一血清型的不同亚型(部分融合有交叉)
(2)用作血清流行病学调查时，将标准抗原置中心孔，周围1，3，5孔加标准阳性血清，2，4，6孔分别滴加待检血清，待检孔与阳性孔出现的沉淀带完全融合者判为阳性，待检血清无沉淀带，或所出现沉淀带与阳性对照的沉淀带交叉者判为阴性。
待检孔虽未出现沉淀带，但两侧阳性孔的沉淀带在接近待检孔时，两端均向内弯曲者可判弱阳性，若仅一条弯曲，另一条仍为直线者，判为可疑，需重检。重检时，可加大检样的量。
检样孔无沉淀带，但两侧阳性孔的沉淀带在接近检样孔时变模糊、消失。可能为待检血清中抗体浓度过大，致使沉淀带溶解，可将检样稀释后重检。
(3)用以检测抗血清效价时，将抗原置中心孔，抗血清倍比稀释后，置周围孔，出现沉淀带的血清最高稀释倍数，为其琼扩效价。
4．注意事项
(1)不规则的沉淀线可能是加样过满溢出，孔型不规则，边缘开裂或孔底渗漏，孵育时没放水平，扩散时琼脂变干燥，温度过高蛋白质变性或细菌污染等因素造成。
(2)抗原抗体的比例与沉淀带的位置、清晰度有关。如抗原过多，沉淀带向抗体孔增厚和偏移，反之亦然。可用不同稀释度的反应液试验后调节。
(二)双向单扩散 该法是在含抗血清的琼脂板上打孔，加入抗原，由孔内向四周辐射扩散，与琼脂中的抗体反应形成沉淀环，此沉淀环随扩散时间而增大，直至抗原抗体反应平衡为止。沉淀环直径与抗原浓度呈正比。因此可用已知浓度的抗原制成标准曲线，检测未知抗原的量。
1．试验方法
(1)用含0．01%硫柳汞的pH7．2，0．01M磷酸盐缓冲液配制2%琼脂糖溶液，溶化后以10ml分装试管，置56℃水浴中保温。
(2)吸等量抗血清于另一试管中，置同一水浴中保温，玻片和吸管等用具也应预温至45～50℃。
(3)将预温好的抗血清和等量琼脂混匀，倾注浇板或用吸管吸出浇板，避免产生气泡。
(4)待琼脂凝固后打孔，孔径3mm，每孔间距应是可能出现沉淀环直径的1．5到2倍，常需预备试验决定，一般孔距为2cm。
(5)将琼脂板置水平台上，用微量进样器准确加样，每孔10μl。
(6)将加好样的琼脂板置密闭的湿盒中37℃扩散至反应平衡，出现明显沉淀环时，测定其直径。一般浓度低者出现早，高者出现迟，分别记录之。
(7)先用已知浓度的抗原测定标准曲线。抗原浓度与环的直径的平方呈线性关系，以抗原浓度为横坐标，沉淀环直径的平方为纵坐标，连接图上各点，只有其中直线部分适用。未知浓度的抗原依沉淀环直径可在标准曲线上查出其含量(图9-2)。此外，也可按直线回归方程计算含量。
图9-2 辐射扩散沉淀环形成图
2．注意事项
(1)绘制标准曲线首先应选出最适当的抗体浓度，即抗体浓度最小，沉淀环直径最大，轮廓最清晰时的浓度。然后固定抗体浓度，将已知浓度的标准抗原稀释成不同浓度与之进行反应，以绘制标准曲线。
(2)本法亦可用于抗体的定量，即将抗原混入琼脂凝胶中，抗体在孔内扩散。
(3)本法误差可能来于以下方面。
①抗原溢出加样孔或孔内有气泡。
②抗原或抗体比例不当，沉淀环过小或过大。
③加样孔破损，沉淀环不规则。
④浇板时不在水平台上，致琼脂板厚薄不均，或扩散时湿盒不平，致沉淀环不圆。
⑤板浇好后保存时间太长，引起凝胶水分蒸发、变形，或抗体失活。
四、琼脂免疫电泳
琼脂免疫电泳是琼脂平板区带电泳和双向免疫扩散两种方法的结合。该法分为两步进行，首先复合抗原各成分随电泳迁移率不同经电泳后分开，然后加上抗血清与分开的各成分在琼脂中相向扩散，每一种蛋白都和相应的抗血清反应从而形成大小、弧度和位置不同的沉淀带。因此可用于分离和鉴定混合物中所含成分。
(一)微量法试验步骤
1．用含0．01%硫柳汞的pH8．6，0．05M巴比妥-巴比妥纳电泳缓冲液配制1%琼脂糖溶液，于水平台上将琼脂浇于载玻片上，每片3．5ml。
2．将图型(图9-3)置于玻片下，打孔和开槽，用高电渗的琼脂制备凝胶时，抗原孔应打在中央；如用低或中等电渗的琼脂糖时，打孔应靠近阴板端。然后将样品孔中琼脂挑出。
3．将凝胶板平放在电泳槽中，两槽已分别装好电泳缓冲液，液面高低应用虹吸管加以平衡。
4．用经缓冲液湿润后的滤纸或纱布均匀搭在凝胶板的两端。
5．用微量吸管吸取抗原小心加入孔中，可同时加入微量0．1%溴酚蓝液作指示剂。
6．盖上电泳槽盖，以胶板宽度2～3mA／cm的电流进行电泳。
7．当指示剂距纱布或滤纸10mm左右时，即可关闭电源，电泳时间一般为1～3h。主要与电流大小、缓冲液的种类和离子浓度，抗原的种类有关。
8．电泳毕将琼脂板取出，将槽中琼脂挑出，滴加抗血清加于槽中。
9．置湿盒中，在37℃扩散至出现清晰的沉淀线为止，常为24h。免疫电泳沉淀带形成过程见图9-3。
图9-3 琼脂免疫电泳沉淀线形成图(从上而下)
10．染色后照像保存或制成干片保存。
(二)注意事项
1．进行免疫电泳时应考虑电泳起始点的位置、大小和形态，电泳起始点与琼脂槽之间的距离，抗原、抗体浓度的比例，琼脂纯度，缓冲液的pH和离子强度，使用的电场强度、电泳时间，琼扩的时间和温度等等。
2．电泳分离只能在一个很窄的pH和离子强度的范围内进行，故只有水溶性的物质才有可能进行电泳。离子浓度低，不溶性抗原抗体复合物的沉淀带不能形成，还可能使不溶于水的球蛋白发生非特异性沉淀。在pH＞8．6时会影响特异性沉淀线的出现，pH＜6．5时又可能出现非特异性沉淀线。
3．为得到清晰的沉淀线，需事先测定每一抗原抗体系统的最适比例。
五、对流电泳
对流电泳和双向双扩散一样是利用抗原抗体相向扩散而进行的，只是对流电泳的这种扩散是在电场的作用下进行的，使抗原、抗体在电场中定向移动，限制了双向双扩散时抗原、抗体多方向自由扩散的倾向，提高了试验的敏感性，缩短了反应时间。本法既可用于检测抗原，亦可用于检测抗体，可用于传染病和寄生虫病的诊断和检疫。
(一)试验方法
1．用pH8．6，0．05M巴比妥-巴比妥钠缓冲液配制1%的琼脂溶液，于水平台上将琼脂浇于载玻片上，每块3．5～4ml。
2．以孔径3mm，抗原抗体孔间距离4mm画好图案(图9-4)，置于琼脂板下，打孔，将孔内琼脂挑出。
图9-4 猪气喘病对流电泳
3．将打好孔的琼脂板平放于装好电泳缓冲液的电泳槽上，用经缓冲液浸湿的滤纸或纱布均匀搭在琼脂板的两端。
4．用微量进样器将抗血清加于阳性孔，抗原加于阴性孔，以2～4mA／cm的电流电泳1小时左右，可出现肉眼可见的沉淀线。
5．电泳毕，若无沉淀线出现，放置15到30分钟，让其扩散后即可出现沉淀线(图9-5)。
图9-5 可检查特异性的对流免疫电泳
6．染色和照像等保存方法同前。
(二)注意事项
1．琼脂应选用电渗作用大的，不宜采用纯度高的琼脂糖，因对流电泳是利用带微弱的负电荷的抗体受电渗作用的影响向负板泳动，带较强的负电荷的抗原能抵抗电渗作用而向正板泳动，达到两者相遇的目的。因此，向一个方向泳动的抗原抗体系统是不能进行对流电泳的。
2．某些带正电荷的抗原，可将抗原置正极孔，抗体置负极孔，并适当降低电泳缓冲液pH，进行反向对流电泳。
3．抗原抗体比例不适合会严重影响沉淀线的出现。除应用高亲和力的血清或单抗外，每份得检样品应选2～3个稀释度进行。
4．为排除假阳性反应，可依图9-5在待检样品孔旁并列一阳性抗原孔作对照，只有当这两条沉淀线完全融合才能判为阳性。
5．对流电泳可与酶标技术相结合，称为酶标对流电泳，可提高敏感性8～16倍。
六、火箭电泳
火箭电泳是1966年由Laurell建立的，将单向单扩散和电泳技术相结合的方法。该法让抗原在电场的作用下在含抗体的琼脂中定向泳动，二者比例合适时形成类似火箭样的沉淀峰，抗原浓度与沉淀峰高度成正比，故可用作抗原的定量测定。
(一)试验方法
1．用pH8．6、0．05M巴比妥—巴比妥钠缓冲液配制2%琼脂糖溶液，溶化后以10ml分装试管，置56℃水浴中保温。
2．吸等量抗血清于相同试管中置同一水浴中保温，玻片和吸管等用具也应预温至45～50℃。
3．将预温好的抗血清和等量琼脂混匀，倾注浇板或用吸管吸出浇板，避免产生气泡。
4．待琼脂凝固后，在玻板一端打一排孔，孔径0．3cm，孔距0．8cm，取出孔内琼脂。
5．将上述琼脂板平放于装好电泳缓冲液的电泳槽上，用经缓冲液浸湿的滤纸或纱布均匀搭在琼脂板的两端。
6．用微量进样器将已知浓度的抗原或未知浓度的抗原加于孔中，每孔10μl，以玻板宽度2～4mA／cm的电流，电泳1～5小时左右，直到大部分抗原孔前端出现顶端尖窄且完全闭合的火箭状沉淀线为止。
7．以火箭的高度(或高度的平方)为纵座标，抗原浓度为横座标，绘制标准曲线(见图9-6)，也可按直线回归方程通过计算绘制标准曲线。
图9-6 火箭电泳
8．从标准曲线上即可查出未知样品的浓度。
(二)注意事项
1．绘制标准曲线前应选出最适当的抗体浓度，即抗体的浓度最小，加入已知量标准抗原后，所形成的火箭状沉淀线轮廓清晰，前端尖窄而闭合，不同浓度抗原所形成的火箭状沉淀线高度比例适当。选定抗体浓度后，将已知浓度的标准抗原稀释成不同浓度与之进行反应，以绘制标准曲线。
2．抗原抗体比例不适当时，常不能形成火箭状沉淀峰；抗原大量过剩不生成沉淀线或者沉淀线完全不闭合；抗原中等过剩沉淀峰成圆形，唯有当抗原抗体充分按比例结合时，沉淀峰才完全闭合尖窄呈火箭状，抗原含量才与沉淀峰的高度成正比关系。如图9-7所示。
图9-7 火箭电泳
附 与沉淀反应有关的几项内容
(一)介质 琼脂具有“多微孔”的结构，允许较大分子渗入，且对分子移动的阻力很小，加上透明度好，来源方便，处理容易等优点，是免疫扩散中最理想、常用的介质。
琼脂是从海藻中提出的多糖，由琼脂糖和琼脂胶两部分组成。琼脂胶含有硫酸基(
)及羧基(COO-)，由于它们与蛋白质的相互作用，在电泳中会引起电渗现象(EED)。提纯的琼脂糖是由D-半乳糖与3，6-脱水-C-半乳糖交替组成的直链多糖，不引起电渗现象。对流电泳需选用电渗作用大的琼脂进行，其他方法则选用中等或低电渗作用的琼脂糖进行，除电渗作用外，琼脂糖的凝胶强度、溶解度、凝胶化程度等均与其质量有关。
免疫扩散中醋酸纤维膜一类的介质也可使用，尽管使用方便，但透明度不好，影响分辨力是其缺点。微孔凝胶如淀粉、聚丙烯酰胺一般不用于免疫扩散，因扩散时需时更长，且染色时没结合的蛋白质不易洗出来，但它们可用于免疫结合电泳(IFE)和免疫印迹实验中。
(二)缓冲液 琼脂扩散试验可用生理盐水(0．15MNaCl)作缓冲液，若用pH中性的磷酸盐缓冲液更好。电泳缓冲液常用碱性(pH8．6)，低离子强度(0．05M)的缓冲液。可选用下述配方。
pH7．2，0．01M磷酸盐缓冲液(PBS)
Na2HPO4 1．07g
NaH2PO4·12H2O 0．3g
NaCl 8．5g
蒸馏水加至1000毫升(ml)
pH8．6，0．95M巴比妥缓冲液(VB)
巴比妥钠 10．3g
巴比妥 1．84g
蒸馏水加至 1000ml
(三)凝胶制备 根据试验需要选用不同琼脂，常配成1%［重量(wt)／体积(vol)］浓度使用。
称好琼脂，放入三角烧瓶中，加入生理盐水或缓冲液后于水浴锅上加热溶化。
若不加抗血清于其中，溶化好的琼脂可立即浇板。琼脂溶液可贮存于4℃1周以上重新溶化后使用。反复溶化可致水分蒸发，琼脂和盐类浓缩，而且可能使琼脂颜色变黄，故应尽量减少反复溶化。亦可将琼脂板浇好后密闭于4℃保存待用。
需加入抗体的琼脂溶液溶化后需冷至50～52℃以防止高温破坏抗体的活性。用时，常将溶化的琼脂和抗血清分装于试管，置52℃水浴中，待温度平衡后两者混合，浇板。为防止琼脂冷凝太快，可将玻片、吸管等预热到45～55℃后再使用。
(四)标本染色
1．漂洗 将琼脂板用滤纸包裹，置生理盐水或磷酸缓冲液中漂洗2天，其间换液7～8次，以漂洗掉琼脂中未发生结合反应的抗原和抗体，最后再用蒸馏水浸泡半天除盐。
2．干燥 去掉琼脂板上的滤纸，于上覆盖一块用水浸湿的绸布，上加几层滤纸，于37℃温箱中过夜使干。
3．染色 用流水冲洗掉粘附于琼脂板表面的纤维屑等，然后浸于染料中10～15min。
4．脱色 用脱色液或1%醋酸脱色至背景无毛，用水冲洗，干燥后在常温可保存数年。为延长保存时间，在干燥前置5～10%的甘油中浸泡10min。
5．染色液 考马氏亮蓝R250是最常用的蛋白质染料，在敏感度允许的情况下氨基黑也不错，更高的灵敏度则需用银染色法。
(1)考马氏亮蓝染色液
考马氏亮蓝R250 2g
甲醇 450ml
冰醋酸 100ml
蒸馏水 450ml
搅拌至溶后过滤，室温下贮于密闭的瓶中待用。
(2)氨基黑10B染液 氨基黑10B3g，甲醇450ml，冰醋酸100ml，蒸馏水450ml。用前过滤。
(3)脱色液 甲醇450ml，冰醋酸100ml，蒸馏水450ml。