假单胞菌属
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第274页（10871字）
假单胞菌属属于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，为直形或微弯的革兰氏阴性无芽孢杆菌，0．5～1．0×1．5～1．5～5．0μm。多有鞭毛，能运动。好氧生长，代谢为呼吸型。大多不需要有机生长因子。接触酶阳性，氧化酶阳性或阴性。根据rRNA及DNA的同源性，本属共分5个组，第1组12个种，第2组7个种，第3组8个种，第4组3个种，第5组62个种。动物病原菌基本分布在第1、2组，主要为铜绿假单胞菌，鼻疽假单胞菌和类鼻疽假单胞菌。一些嗜冷菌(不能在25℃以上生长)如荧光假单胞菌、恶臭假单胞菌及鳗败血假单胞菌可致鱼病。
一、铜绿假单胞菌(Ps．aeruginosa)
铜绿假单胞菌亦称绿脓杆菌(Bacillus pyocyaneus)。菌体0．5～0．7×1．5～3．0μm。广泛分布于自然界中，存在于水和土壤中，植物上，人和动物的皮肤和粘膜上及粪便中。为条件致病菌，引起创伤感染和各种化脓性炎症，尿路、呼吸道及生殖道感染，以及肠炎、皮炎、外耳炎及溃疡性角膜炎等。为奶牛和羊乳房炎以及绵羊剪毛腐皮症(fleece-rot)的重要病原菌，也是犊副流感病毒、马流感病毒及猪和绵羊霉形体肺炎等的重要继发菌。在某些群养的小动物、皮毛动物和禽可能群发，引起败血症死亡，如水貂的出血性肺炎，可造成发病而大批感染死亡。为乳、蛋及肉等食品的重要污染菌之一。
培养特性：在普通培养基易于生长。在琼脂平板上37℃培养过夜，菌落一般可达3～5mm，光滑透明，扁平呈磨玻璃样，中心隆起，类似煎蛋外观，边沿不齐，有时扩散生长，粘液型菌落表面有蓝色金属样光泽，在血液琼脂平板上菌落周围有β溶血环。从自然界的分离物通常为小型菌落，粗糙，隆起。培养物通常有姜香味。大部分菌株培养稍长可产生溶于水的色素，菌落及培养基呈青绿色，有时培养基呈红至暗红色。色素有3种，一为绿脓青素(pyocyanin)，呈蓝绿色；一为绿脓荧光素(pyoverdin或fluorescin)，呈黄绿色；另一为绿脓红素(pyorubin)，呈暗红色，均为水溶性。绿脓青素并可溶于氯仿，可在培养物上覆盖氯仿，使氯仿成蓝绿色。绿脓青素为本菌特有，产生时即可确定为本菌。检查绿脓青素和绿脓红素可用King氏A培养基；检查绿脓荧光素可用加有3%明胶的King氏B培养基，在紫外线下观察呈荧光性。
本菌在麦康凯琼脂平板上生长良好，菌落不呈红色(不分解乳糖)。在肉汤培养基中呈均匀浑浊，液面有菌膜，培养液呈绿色。
本菌在42℃可生长，5℃不生长。在好氧培养下，可氧化葡萄糖、甘露醇、伯胶糖、木糖、鼠李糖、产酸不产气，但在OF碱性培养基条件下则不能使双糖类产酸。不氧化麦芽糖、乳糖、蔗糖。氧化酶、明胶酶、酪蛋白酶、乙酰胺酶及精氨酸双水解酶活性均为阳性。V-P、M．R．、H2S、吲哚、苯丙氨酸脱氨酶均为阴性。可利用枸橼酸盐，不分解或微弱分解尿素。还原硝酸盐不定。可氧化葡萄糖酸盐。对溴棕三甲胺(Cetrimide)及萘啶酮酸有耐受性，故可在NAC培养基生长。对庆大霉素、羧苄青霉素有敏感性。
血清学分型：国际上对绿脓杆菌的分型有多种体系。国内是将其O抗原分为12个血清型，分型血清(成都生物制品研究所)可用于人及动物的临床分离株作玻片凝集反应，抗原为活菌或煮沸1～2h的死菌，可定型大部分菌株，且与其他13种假单胞菌都不发生交叉反应。绿脓杆菌煮沸抗原高免兔血清不与鼻疽杆菌、类鼻疽杆菌、产碱杆菌、支气管炎博德特氏菌、不动杆菌等10多种细菌产生交叉凝集反应。绿脓杆菌的非色素产生株不被凝集，可认为变异菌株。
分离和鉴定：临床病料用普通琼脂或麦康凯琼脂平板分离。以污染病料或粪便、泥土或水样分离时，可先用NAC汤或乙酰胺汤增菌，然后用NAC或乙酰胺琼脂平板分离。产绿脓青素的分离物容易鉴别。对未证明有绿脓青素产生和有动力的分离物可进行检查判定。一是在普通琼脂上传代，观察色素产生和动力的恢复；二是具有氧化酶、精氨酸双水解酶及乙酰胺酶，OF葡萄糖产酸阳性，OF麦芽糖产酸阴性，由硝酸盐产生氮气。可根据极生单鞭毛、42℃生长及5℃不生长等，与荧光假单胞菌或恶臭假单胞菌的不产荧光素株鉴别。绿脓杆菌与兽医临床材料中其他常见的非发酵性革兰氏阴性杆菌(NFB)的主要鉴别点见表。
表12-1 一些假单胞菌与兽医临床材料中其他常见非发酵性革兰氏阴性杆菌(NFB)的主要鉴别特性
注：
( )．大多数菌株阳或阴性 V．结果不定 K．全部碳水化合物管产碱 A．产酸表中各菌相应学名如下。
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)
恶臭假单胞菌(Ps．putida)
产碱假单胞菌(Ps．alcaligenes)
类产碱假单胞菌(Ps．pseudoalcaligenes)
嗜麦芽假单胞菌(Ps．maltophilia)
粪鼻疽假单胞菌(Ps．pseudomallei)
鼻疽假单胞菌(Ps．mallei)
施氏假单胞菌(Ps．stutzeri)
腐败假单胞菌(Ps．putrefaciens)
粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)
脱氮产碱杆菌(Alc．denitrificans)
香味产碱杆菌(Alc．odorans)
支气管炎博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)
硝阴不动杆菌(Acinetobacter anitratum)
洛菲(氏)不动杆菌(Aci、lwoffi)
致病性分离株的鉴定：
(1)培养特征。菌落大，不正形，呈明显的粘液性，表面有蓝金属闪光性，β溶血；肉汤培养物形成粘稠壁环及微集落。
(2)实验动物致病性。注射实验动物可引起发病死亡。滴于小白鼠的受伤角膜上可引起角膜浑浊、溃疡和穿孔失明。皮内注射于豚鼠可引起皮肤坏死。
(3)致病性因子。大部分临床菌株可产生外毒素A，部分菌株也可产生蛋白酶和弹性蛋白酶等与致病性有关的因子，证明方法如下。
①蛋白酶和弹性蛋白酶产生：普通营养琼脂粉1．75g，CaCl20．1mol／L20ml，1mol／LTris-HCl缓冲液(pH8．0)15ml，蒸馏水15ml，2%酪蛋白液或2%弹性蛋白液50ml，充分搅拌混合，121℃15min灭菌，每平皿分装10ml，接种细菌，37℃24～48h，菌落周围有溶解环者分别为蛋白酶或弹性蛋白酶产生。
②外毒素产生：取胰酶酪蛋白豆汤的透析，外液加入1%甘油、1／20量1mol／L谷氨酸钠、1／100量1mol／L腈三醋酸制成培养基，121℃15min灭菌，每管分装15ml，接种培养物-铂圈，37℃水浴振荡培养48h，10000r／min离心20min，取上清液作为琼扩试验的外毒素抗原液。抗血清为提纯外毒素的类毒素高质马血清。琼扩试验同马传贫或一般琼扩试验，室温24～48h判定结果。
主要培养基成分及使用方法如下。
1．萘啶铜酸-溴棕三甲胺(NAC)琼脂 蛋白胨20g，KH2PO40．3g，MgSO4·7H2O0．3g(另配水溶液，制平板前加入)，溴棕三甲胺(十六烷基三甲基溴化铵)0．2g，萘啶铜酸15mg，琼脂粉1．5%，蒸馏水1000ml，pH7．4～7．5，121℃25min，倒平板。
划线接种，37℃24h，绿脓杆菌生长良好，其他菌不生长。绿脓杆菌色素产生良好，荧光素产生强。
液体培养基不加琼脂，分装试管，37℃培养过夜，如有绿脓杆菌生长，则上部液层呈绿色为多。
2．乙酰胺琼脂 乙酰胺2g，氯化钠5g，MgSO4·7H2O0．2g，NH4H2PO41g，K2HPO41g，琼脂2%，蒸馏水1000ml，pH7．4～7．5，121℃25min，倒平板。
划线接种，37℃24h，绿脓杆菌生长良好，其他菌不生长。
液体培养基不加琼脂，分装试管。
3．甘油肉汤、甘油琼脂 营养肉汤或营养琼脂，含甘油3%，可供鼻疽杆菌、伪鼻疽杆菌等生长用；含甘油达5～10%，还可供结核杆菌生长用。
4．马铃薯斜面与甘油马铃薯 选大的马铃薯，洗净，去皮，再冲洗数次，以大的钻孔器(直径略小于试管)钻取圆柱形薯块若干条，每条斜切为两半，每一半有底柱及3cm以上斜面，分装于试管中，底柱在下，斜面在上，管底事先垫少许脱脂棉。每管加无菌水将整个马铃薯淹住，以蒸气蒸半小时，将水倾去，加试管盖或试管塞，置高压锅中灭菌，10磅20min，冷，取出，置37℃培养3日。无菌者备用，是为马铃薯斜面。
以5%无菌甘油代替无菌水，同上法制备，为甘油马铃薯。
上述培养基供假单胞菌属等应用。
5．色素产生培养基
King氏A培养基：蛋白胨(Bacto)20g，甘油(C．P．)10ml，氯化镁1．4g，硫酸钾10g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，pH7．2，分装试管，121℃15min，放成深底层半斜面。用于绿脓杆菌产生绿脓青素。37℃24h后放室温5天，或37℃48h以上。
King氏B培养基(赵占春等改良)，3号
蛋白胨20g，甘油10ml，磷酸氢二钾1．5g，硫酸镁1．5g，琼脂15g，明胶30g，蒸馏水加至1000ml，pH7．2，121℃，10min，放成深底层半斜面。用于荧光组假单胞菌产生绿脓荧光素。35℃l～5天，在紫外光下观察，出现黄绿色荧光为阳性(在散射光下观察，色素发现率低)。
特殊染色检查法方法如下。
1．细菌鞭毛染色法(中国科学院水生生物研究所)
染色液：甲液——饱和钾明矾液2ml，5%石碳酸液5ml，20%鞣酸液2ml。乙液——碱性复红或龙胆紫酒精饱和溶液。取甲液9份与乙液1份混合，隔夜过滤后使用。
2．染色方法：将待检细菌接种肉汤，逐日移植连续7代。于普通斜面上加2ml蒸馏水，自最后一代肉汤培养物取一铂圈接种于与液面接触的斜面上，依次向上划线，28℃培养7～16h。用铂圈从与水的接触面轻取菌液，放入已准备好的蒸馏水内，置培养箱培养4-5min，使细菌散开。取此菌液一铂圈，放至清洁、无油脂、干燥的载玻片上，置培养箱中自行于燥(不能用火焰固定)。加染色液染0．5～1min，轻轻水洗，干后即可镜检，菌体与鞭毛均呈红色或蓝紫色。
3．细菌嗜苏丹黑颗粒染色(Burdon，1946)
(1)涂片，充分风干，火焰固定。
(2)苏丹黑B溶液(粉末染料0．3g，70%乙醇100ml)覆满全片，室温静染5～15min。
(3)倾去多余的染液，吸水纸充分吸干。
(4)将染片反复浸入化学纯二甲苯，或用滴瓶往片上加二甲苯清洁染片，吸干。
(5)0．5%沙黄水溶液复染5～10s。
(6)水洗，吸干。
注意事项：
(1)苏丹黑溶液配成后，应不时充分振动，用前静置过夜。用化学清洁的玻瓶保存，在室温可保持数月。
(2)染液应覆满全片，防止蒸发过快。
(3)复染不可太强，以免模糊很微小的脂肪滴。
(4)检验人员应对胞内脂肪小滴的蓝黑色或蓝灰色与复染的品红色有良好的色辨能力。
以苏丹Ⅲ或Ⅳ代替苏丹黑B的染色方法。
(1)染液：96%酒精70ml，蒸馏水10ml，10%NaOH20ml，苏丹Ⅲ或Ⅳ0．2g。
(2)染色方法：抹片，火焰固定。苏丹Ⅲ或Ⅳ染液静染20min。水洗，碱性美蓝染液染10min。水洗，吸干。镜检：以鼻疽杆菌为例，菌体浅蓝色且着色不匀，有的周围着色，有的两极染色。菌体内普通染色法不着色的空泡样物质多染成淡玫瑰色。
附录3 特定酶活性检查法
1．乙酰胺酶活性检查(陈德馥等，1985)
培养基：K2HPO42g，MgSO4·7H2O0．1g，CH3CONH2(乙酰胺)1g，NaCl5g，蒸馏水1000ml，pH6．8，每小管分装1ml， 15磅25min。
接种1铂圈细菌于培养基小管中，37℃培养，每2h取一管滴加产氨试验的奈氏试剂一滴，产生红棕色为阳性。绿脓杆菌2h即有乙酰胺酶产生，其他假单胞菌不产生。
2．细菌细胞色素氧化酶活性检查
氧化酶试剂：
(1)Galy及Hadley试剂——甲液为α萘酚1g，95%乙醇100ml。乙液为二甲基对苯撑二胺(又名对氨基二甲基苯胺)1g，蒸馏水100ml。后者以盐酸盐结晶品配制时，结晶应为淡色不发黑，甚不稳定，应贮于冰箱。配制液如呈黑色，应以木炭吸收过滤，滤液呈玫瑰红色，紧塞贮于冰箱。草酸盐比盐酸盐稳定，其水溶液可保存6个月以上。
(2)Kovacs试剂——四甲基对苯撑二胺1%水溶液，比二甲基对苯撑二胺敏感，但不稳定，每次用前新配，放于暗处15min后使用，配成后2h失其活性。草酸盐比盐酸盐稳定。如试剂由无色变成深蓝色，应弃去不用。
洋葱假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、多杀巴氏杆菌、流感嗜血杆菌及博德特氏菌以Galy试剂检查氧化酶时为阴性，以Kovacs试剂检查则呈阳性。
试验方法：
(1)滤纸法——将滤纸片置玻片上或平皿内，滴上Galy试剂乙和甲液各等量，使滤纸饱和试剂，或滴上Kovacs试剂饱和滤纸，以接种环(白金或玻璃做)取18～24h琼脂培养基菌落在滤纸上涂抹，在10～60s内呈深蓝或紫黑色为阳性反应；或5～10s内为阳性反应，10～60s为迟延反应。
(2)菌落或菌苔直接试验法——先取Galy试剂甲液一铂圈接触菌落或菌苔，再取一铂圈乙液接触同一处，反应判定如上。如需移植，应在菌落还未变为黑色仍为粉红色时进行，否则细菌死亡。
(3)液体培养物直接试验法——18～24h肉汤培养管，加入Galy试剂甲液0．2ml及乙液0．3ml，用力振动，出现深蓝色为阳性反应。绿脓杆菌于15～30s内呈阳性，粪产碱杆菌于2～5min呈阳性且蓝色扩展缓慢。
二、鼻疽假单胞菌(Ps．mallei)
鼻疽假单胞菌亦称鼻疽杆菌(Bacillus mallei)。0．5×1．4～4．0μm，由于培养传代，具有多形性。通常单在、成双，也见并列成堆。菌体染色往往不均匀，菌体内具有嗜苏丹黑颗粒。无鞭毛不运动。无荚膜但有封套。为马属动物鼻疽病的病原菌，亦可传染人和狮、虎等猫科动物。在感染动物不存在无病变的带菌现象。细菌在自然环境中活存时间较短，为兼性寄生菌。
培养特性：最适生长温度37℃，最适生长pH6．4～6．8。在营养培养基内加入4%甘油可促进生长。在甘油琼脂平板上生长较慢，补加10%血清和0．1%红细胞裂解液并培养42～48h，长出菌落光滑湿润，浅橙黄色半透明，边缘圆整，隆起，直径约1mm。在显微镜下以折射光线扩大观察，新分离株菌落结构较细致，呈橙黄带金光，两侧带鲜明绿蓝光，前缘带黑褐色有细刻纹，具有鉴别特征性。继续培养时，一些菌株渐呈浅棕黄色，粘性增加，透明度减低，另一些菌株仍保持灰白半透明菌落。在甘油肉汤中培养2天呈轻度均浊生长，以后形成少量光滑壁环，管底粘着少量粘稠生长物，摇动试管时呈特征性发辫状旋起，不易摇散。在甘油马铃薯上初形成浅黄或浅棕黄色透明粘稠菌苔，一周后色渐加深呈棕黄色或略带红色，不透明蜂蜜样。在麦康凯琼脂等选择培养基上不能生长。
分解糖类的能力很弱也不规律。培养5天以后，可分解葡萄糖产酸，10天以后某些菌株可使半乳糖、伯胶糖产酸，有的菌株可能使甘露醇、果糖、甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖、杨苷或海藻糖不同程度产酸。分解蛋白胨产碱。石蕊牛乳产酸变红，4～10天凝固，缓慢消化。10天后可缓慢液化明胶。产生硫化氢，于4～7天多较明显。尿素酶阴性，氧化酶及接触酶阳性。产生吲哚，还原硝酸盐但不产生氮气。M．R．及V．P．阴性。无溶血性。
抗原关系：鼻疽杆菌与类鼻疽杆菌存在共同的K和O抗原。
抗菌药物敏感性：对四环素类、混旋氯霉素、链霉素、新霉素及增效磺胺(特别是TMP／SMZ、TMP／SMM及TMP／SM′Z)敏感。对多粘菌素B、杆菌肽及新生霉素不敏感。
分离和鉴定：操作过程中严格防止散菌和人身感染。
(1)病料采取——临床病料包括鼻腔拭子(拭子达鼻腔中、后部)、体表脓汁拭子、脓疱穿刺脓汁、胸腔抽出渗出液、去势病睾和精索脓汁或病灶、急性病例的血液等。扑杀或病死动物的常发器官如肺、肝、脾、淋巴结、鼻腔、扁桃体等的病灶。
(2)培养基——常用血清血红素甘油琼脂平板和甘油肉汤。鼻汁和开放病灶等污染病料，可在平板中添加多粘菌素E10u／ml和杆菌肽12．5u／ml或者青霉素及多粘菌素各20～50μg／ml。
(3)培养分离方法——污染病料(拭子)先以含有多粘菌素和杆菌肽或者青霉素和多粘菌素(浓度同上)的生理盐水或甘油肉汤，于37℃或室温预处理30min。器官的陈旧病变组织最好先剪碎研磨。每份病料应接种平板数个，根据污染和病变新陈情况，作划线接种或浓厚涂布。平板在37℃培养42～72h观察，挑取可疑菌落移植鉴定。甘油肉汤和斜面培养至第5日，移植平板进行分离鉴定。
病料悬液(包括抗菌素预处理的拭子悬液)还可以同时接种实验动物进行病原分离。
细菌分离率以平板直接法最高，其后依次为地鼠、豚鼠、小白鼠接种法，各法最好结合应用。
分离物主要与其他NFB特别是绿脓杆菌和类鼻疽杆菌(对豚鼠亦均可引起睾丸炎)等假单胞菌、产碱杆菌、不动杆菌和支气管炎博德特氏菌鉴别。鼻疽杆菌无运动性，表面菌落特征与类鼻疽杆菌及绿脓杆菌有明显区别，容易鉴别，特性鉴别见表12-2，并参见表12-3。
表12-2 实验动物接种分离鼻疽杆菌
表12-3 鼻疽杆菌与类鼻疽杆菌及绿脓杆菌的鉴别表
注：p．部分抑制；d．结果不定
三、类鼻疽假单胞菌(Ps．pseudomallei)
类鼻疽假单胞菌又名类鼻疽杆菌(Bacillus pseudomallei)或惠特莫尔氏杆菌(Bacillus whitmori)。菌体0．6×1．5μm，由于培养条件不同，具有多形性。通常单在、成双，常并列成堆。菌体染色往往不均匀。新分离株往往呈两极浓染的短杆菌，有人形象为“安全灯”状。无荚膜但有封套。以3根或多根极生鞭毛运动。在疫源地为水和土壤中的正常栖息菌，可侵害各种动物，引起“类鼻疽病”。疫源地限于热带、亚热带，主要在东南亚。类鼻疽病已报告于人、马属动物、牛、猪、绵羊、山羊、猫、狗及若干啮齿动物，以猪、绵羊和山羊发病较多见。
培养特性：最适生长温度为37℃，最适生长pH为6．9±0．1。在普通琼脂培养基上容易生长，但加甘油可促进生长。生长较快，新分离株在4%甘油琼脂平板上为小而光滑圆整的半透明菌落，具有金属闪光性，在斜射光线下观察有荧光。48h后菌落增大，变为扁平干燥，出现同心层，表面起皱，边缘有细纹，粘稠。72h因产淡黄褐色素而不透明，一周后菌落皱襞重叠。初代分离物24h也有呈特别粗糙皱襞型的，毒力强。在麦康凯琼脂平板上，菌落初成淡红色，4天后变为鲜明的深红色，并产生菌落型的分化。在血液琼脂平板上菌落粗糙，24h部分溶血，再经3天可完全溶血。肉汤培养均浊，液面形成厚菌膜，经4～5天形成皱襞，管底有粘稠沉淀。明胶5天完全液化。牛乳2～3天变酸凝固开始消化。在甘油马铃薯上，生长类似鼻疽杆菌，但更呈奶油状，可形成皱襞。在各种培养基生长均发散一种土霉气味，不产生可溶性色素。
分解糖类及利用有机化合物的范围明显宽于鼻疽杆菌，但分解糖类同样缓慢微弱，葡萄糖、甘油、果糖3天微酸，其他糖类均在10天以后微酸。吲哚、MR、V-P及尿素酶均为阴性，可利用枸橼酸盐及还原硝酸盐。H2S阴性或少量。
抗菌药敏感性：对长效磺胺、四环素及氯霉素敏感，对青霉素、头孢菌素Ⅰ及多粘菌素B抗药。
分离和鉴定：
(1)病料采取——临床病料采取参见鼻疽杆菌，包括伤口和脓疱拭子，鼻腔拭子，尿样，痰样(人)及血液等。疫源地调查采集土壤、沼池水和稻田水等，样品先以絮凝集菌法集菌，即表面水样100ml，或沼池附近表面土壤约100g加生理盐水200ml的浸渍上清液，加硫酸铝钾25mg，再加炭酸氢钠25mg，摇动，沉淀30min，滤纸过滤，将滤纸上的沉淀物洗入平皿。
(2)培养基——常用4%甘油营养琼脂，污染材料于培养基中添加头孢菌素Ⅰ40μg／ml及多粘菌素E100μg／ml。
(3)培养分离方法——参见鼻疽菌。污染材料可先以头孢菌素Ⅰ及多粘菌素E(浓度同上)作预处理。平板于24、48及72h各观察一次。
病料悬液可同时接种实验动物进行细菌分离。实验动物的敏感性依次为地鼠、豚鼠、家兔和小白鼠，可选用地鼠和豚鼠。豚鼠除注射途径外，也可以皮肤划痕、日服和鼻腔涂布。
类鼻疽杆菌集落通常容易识别。但以甘油琼脂平板分离时，施氏假单胞菌菌落亦呈粗糙皱襞型，应注意鉴别。类鼻疽菌与鼻疽菌及绿脓杆菌等NFB的特性鉴别见表12-1及表12-3。
类鼻疽杆菌煮沸抗原高免兔血清以玻片凝集反应检查活菌，除与鼻疽杆菌有交叉凝集外，与绿脓杆菌、荧光假单胞菌、嗜麦芽假单胞菌、施氏假单胞菌、食酸假单胞菌、粪产碱杆菌、支气管炎博德特氏菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、硝阴不动杆菌及变形杆菌等均不呈交叉凝集。