负染标本的制备

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第582页（1894字）

此法的优点是快速和简单，用于检测细胞外游离的病毒，特别适用于难以培养的病毒。应用范围并不广泛，主要原因是样品中病毒浓度必须不低于10⁷／ml，而一般不易达此要求。

一、器材准备

(一)负染溶液 通常用2%磷钨酸钠水溶液，pH6．8～7．0。配制时以1mol／L KOH校正pH，贮存于4℃。如发现溶液中有细菌，则用过滤法除去。

(二)铜网 网孔为200～400目均可，以300目最常用。铜网上加一层聚乙酸甲基乙烯酯(Formvar)支持膜，但最好在此膜上再真空喷涂一层碳加固膜。

二、方法

(一)直接法 样品中不含盐分，或含量极少时可直接加于铜网上，不必经预处理。用毛细吸管吸取样品液加一滴于铜网上，再加一滴负染液，将铜网接触吸水纸的边缘，吸去多余混合液，在空气中稍干(1～2min)后即可检查。

根据各人喜爱，染色方法多种多样，但原理都无差异，即将样品液和染液混合后加在铜网上，或铜网先接触样品液后接触染液。

(二)水滴法 大多数样品液中含有较高浓度的盐份，如令其在铜网上干燥，就会结晶出来而淹没了病毒子。克服这个缺陷的方法，可取样品液(病毒子必须达109／ml)1微滴加于1滴蒸馏水上，将铜网轻轻触及液面，迅即取下作负染。

(三)琼脂扩散法 此法特别有用于病毒浓度低而又含盐的样品，检出低限约为10⁷／ml。方法如下。

1．在微量滴定板的U形孔中滴加1%琼脂(用蒸馏水配制)至2／3满。

2．琼脂凝固后每孔加一片铜网。滴定板至此可立即应用或用透明胶带密封，在4℃可保存数周。

3．使用时在铜网上加1～2滴样品液，置室温中干燥(15～30min)。

4．加1滴负染液，1min后用镊子取下铜网，稍干后作电镜检验。

(四)用冻融法裂解细胞

1．一小块组织(1mm³)放于金属小匙内。

2．将小匙反复接触-60～-80℃的酒精和手掌，使冻融4～6次。

3．加1滴蒸馏水，再冻融一次。

4．用毛细吸管将组织悬液略加混匀。

5．吸1小滴加于铜网上。

6，负染后稍干，镜检。

三、镜检

1．通常每一铜网样品的检查不超过15min。

2．筛选时尽量使用同一个放大倍数，如40000倍，便于检查者熟悉病毒子的相对大小。

3．先用低倍镜检查铜网，选择中等密度的方格，再作高倍检查。

4．由于病毒子的外周能吸附染液，因此能从背景碎片中明显区分。

四、样品处理

1．水泡液或痂皮 从痘病毒、疱疹病毒、口蹄疫病毒、猪水泡病毒等形成的水泡中采得的水疱液作直接检查效果极佳，因为病毒浓度极高。未破的水泡用酒精消毒后以毛细吸管直接刺入，吸取少量水疱液加于铜网上，或者用琼脂扩散法加样。如水泡已破无液可吸，则取下痂皮，内面向下，在载玻片上的1滴1%醋酸铵溶液中反复涂磨。弃去痂皮，再加1滴醋酸铵，以铜网复于液面上，稍顷，取下负染。也可从取下痂皮后的创面用针头括取病料，涂于载玻片上，干后加1滴1%醋酸铵浮悬，再用铜网制备镜检标本。

2．其他样品 呼吸道分泌液、粪便、组织悬液等样品可先用8000～10000xg离心30min，取上清液以100000xg离心60min，弃去上清液，在沉淀中加数滴蒸馏水，以吸管吹吸使沉淀分散悬浮，取1小滴加于铜网上制备镜检标本。