免疫电镜术

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第584页（2642字）

应用免疫电镜术可以在电镜下直接看到抗原—抗体的复合物，它在检测和鉴定某些分离和培养困难的病毒非常有用，也可用于病毒的分型。

一、材料准备

(一)病料中的病毒 病料中病毒含量较低，不适于作直接电镜检查时，此法甚为有用。如果病毒量达到检出水平，病料不需经澄清或浓缩等预处理，但通常先用8000xg离心30min，除去细菌和组织碎片后效果更佳。如果病毒含量太低，则必须先经浓缩，如超速离心、密度梯度离心、聚乙二醇处理等。

(二)细胞培养中的病毒 检出率比没有抗体时增高达100倍。检测时常常不需将培养物浓缩或提纯。

(三)抗血清 不论是标准抗血清或是康复血清，都能直接应用而取得满意的结果。如果抗血清不清朗，则必须经100000xg离心1h，除去沉淀物。试验前血清必须加热灭活，以避免补体的干扰。用于血清学分型时，抗体与病毒之比可能会影响试验的特异性。在肠道病毒分型中，将分型血清稀释1／50以上时区分很清楚，但如血清不稀释或稀释度较小，则发生交叉反应。在其他病毒中也如此。

抗血清的浓度可影响免疫复合物的出现。当抗体浓度过低时，凝聚物很小，只有几颗轮廓清晰的病毒子，随着抗体浓度的增高，凝聚物变得更大和更多，互相连接的抗体层更厚，病毒子表面详细结构不清晰。抗体浓度过高时，各个病毒子都包上一层抗体，凝聚物反而大为减少。

二、方法

(一)直接法 最常用的方法是将病毒液与抗血清等量混合，在37℃1h，再在4℃过夜。翌日晨将混合物用10000xg离心30min，使免疫复合物沉淀。对于小病毒(如微RNA病毒)最好用13000xg离心，而大病毒(如痘病毒)则用普通离心机即可。将沉淀物悬浮于少量蒸馏水中，然后制备标本和负染。有些学者省去4℃过夜的步骤，仅在37℃1h也获得成功。

(二)间接法 病毒与抗体结合后再用抗IgG抗血清处理。此法更为敏感，用于腺病毒分型时，敏感性提高4～32倍。应用方法以腺病毒检测为例。

1．临床样品与适当稀释的抗血清各1／2ml混合。

2．在37℃1h，再在4℃3h。

3．混合物经12000xg离心30min，沉淀物悬浮于0．5mlPBS中。

4．加等量适当稀释的抗IgG血清后在4℃16～20h。

5．12000xg离心30min。

6．沉淀物悬浮于0．1ml蒸馏水中。

7．制备铜网标本、负染、镜检。

(三)琼脂扩散过滤(ADF)法

1．病毒和抗血清混合后在37℃培养30min。

2．琼脂凝胶的准备与电镜检验中琼脂扩散法相同。

3．将病毒和抗血清混合液1微滴加于琼脂上。

4．将铜网覆盖在液面。

5．数分钟后液体全部扩散到琼脂内。

6．取下铜网，负染后检查。

琼脂具有分子筛的功能，有效地除去有干扰作用的盐类、大分子和小组织碎片，而病毒子仍留表面。所制备的标本得到部分纯化和浓缩。

(四)血清琼脂(SIA)法

本法是ADF法的改进，是将血清混入琼脂中。具体方法如下。

1．用蒸馏水配制1%琼脂，融化后冷至56℃时加入适当稀释的抗血清，混匀。

2．注入微孔滴定板的U形孔内至2／3满。

3．凝固后每孔加一铜网，涂膜面向上。

4．取待检病毒样品1～2微滴加于孔内，空气中干燥(约30min)。

5．取下铜网，负染，镜检。

SIA法迅速而简便，只需少量病毒和抗血清。虽然抗血清混于琼脂内，但同源抗体能迅速扩散到病毒样品中而形成免疫复合物。此法用于肠道病毒分型时敏感性和特异性与直接法相当，然而从实用观点看SIA法更为有用，因为制备好的微量滴定板在4℃可保存数月，随时可用。此外可同时制备几种不同型的抗血清，供选择使用。

(五)快速法

1．铜网上滴加适当稀释的抗血清(如抗血清的滴度为1∶1000，则稀释成1∶10或1∶100，稀释液用pH7，0．1mol／LPB)。

2．将铜网放在湿盒中，室温5min)。

3．用镊子夹住铜网，以20滴PB液淋洗，吸去余液。

4．滴加粗制待检病毒样品液，在湿盒中放置15min。

5．铜网依序用20滴PB、30滴H₂O和5滴染液淋洗。

6．吸去余液、镜检。

此法的整个过程仅需25分钟，准备工作很简单，但效果显着。在电镜下看到的病毒子数比用无关血清处理者增加30～50倍。铜网上杂质少，病毒形态清晰。