正粘病毒科

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第734页（4502字）

正粘病毒为单股、分节段的RNA病毒，多形，多数呈球形，直径约80～120nm。病毒的囊膜上有血凝素和神经氨酸酶两种纤突。

正粘病毒科下设流感病毒和C型流感病毒二属。通常经飞沫水和直接接触感染。根据流感病毒的表面抗原(血凝素、神经氨酸酶)的差异分为许多亚型。流感病毒的表面抗原常发生变异。

鸡胚是繁殖流感病毒最简单而常用的系统。貂是流感病毒最好的实验动物模型。

流感病毒的命名(1971)采用型／宿主／分离地点／毒株序号／分离年份(血凝素、神经氨酸酶的亚型序号，并标明动物属性)。例如：A／马／布拉格／1／56(Heq-1Neq-1)。人流感病毒则省略宿主标志，例如：A／香港／1／68／(H₃N₂)。

兹将1980年2月，世界卫生组织会议修订的甲型流感病毒血凝素亚型与神经氨酸酶亚型与1971年以来，国际上通用的命名法对应关系列表49-1和表49-2。

表49-1 甲型流感病毒血凝素抗原亚型的对应关系

*某些实验室应用免疫扩散试验曾在H₁和H₅亚型病毒之间发现微小的抗原联系。sw表示猪eq表示马，av表示禽。

表49-2 甲型流感病毒神经氨酸酶抗原亚型的对应关系

流感病毒属(lnfluenzavirus)中迄今只发现甲型流感病毒的某些血清型能引起畜禽流感。

一、马流感病毒(Equine influenza virus)

马流感的病原为马甲₁型(H₇K₇)及马甲₂型(H₃N₈)流感病毒。它们之间无交叉免疫性。自然条件下，只引起马属动物发生流感，传播迅速，在易感马群中发病率有时可达100%。

(一)样品采集

1．病毒分离标本的采集 用灭菌棉拭，采取出现临床症状3日内的马鼻腔分泌物，浸入pH7．2～7．6肉汤、Hank′s液或生理盐水中，立即放入冰瓶，尽快送检。实验室将样品充分振荡，将粘液打碎，静置5～10min，待其自然沉淀，取上清液加青霉素2000IU／ml，链霉素2000μg／ml，若不能及时接种，标本应置低温冰箱保存。

2．血清标本的采集 无菌手术采取双份血清，第一份来自发病3日内，第二份在发病后2～3周，血清置一20℃冰箱保存。为了尽快作出诊断结果，也可采集一些急性期病马和康复马的血清，各种血清至少10例。

(二)病毒分离

1．细胞培养 马流感病毒能在鸡胚成纤维细胞、仓鼠肾细胞、绿猴及恒河猴肾细胞、牛肾细胞及仓鼠肺传代细胞Hmulu内增殖，出现细胞病变。基本步骤如下。

(1)接种前弃去生长液，用Hank′s液洗1～2次。

(2)每管接种标本液0．3ml，33～35℃吸附1h，用Hank′s液洗1～2次，加入维持液(一般用199或Eagle′s液)，置33～35℃培养。

(3)每日镜检，如出现细胞病变，可吸取维持液检查血凝特性。若无细胞病变，72h起隔天抽取1管，先吸出维持液作血凝试验，将细胞单层作血吸附试验，同时用正常细胞管以同法进行对照。如血吸附阳性，取已收获的维持液滴定血凝滴度，如血吸附阴性，可将全部收获液混合进行盲传。二至三代后仍为阴性者弃去。

如收获液血凝滴度＞1∶4，即可用血凝抑制试验进行病毒鉴定。如＜1∶4则需继续传代提高血凝滴度后再行试验，或用血吸附抑制试验进行鉴定。

2．鸡胚接种

(1)用10～12日龄鸡胚，每胚注入0．2ml标本液于羊膜腔内，然后将针头自羊膜腔稍稍上提，使针头位于尿囊腔中，再注入0．2ml。每份标本接种4枚鸡胚。

(2)置33～35℃孵育3天，24h内死者弃去。孵育到3天时，将鸡胚置4℃冰箱过夜(或-30℃快速冷却1h)。

(3)每胚分别收获尿液和羊水进行血凝和血凝抑制试验。如血凝阴性，则将4胚羊水等量混合，仍用上法进行育传2代(共3代)，仍为阴性者弃去。

(三)血清学试验 血凝和血凝抑制试验可用于流感病毒的鉴定，血凝抑制试验还常用于测定血清抗体的水平。应用双份血清进行血凝试验时，当第二份比第一份的抗体滴度增高4倍，则可判为动物被病毒感染。血凝滴度以出现“++”凝集的病毒稀释度算作一个单位，血凝抑制滴度是以完全抑制血凝的血清稀释度。进行血凝抑制试验的血清应事先除去非特异性血凝抑制物。方法如下。

1．受体破坏酶(RDE)又称神经氨酸酶处理法。

免疫血清1份加入受体破坏酶4份，37℃水浴过夜，然后56℃水浴50min，以破坏残余的受体破坏酶的活性。经此法处理的血清最终稀释度为1∶5。处理后的血清若对鸡红细胞有非特异性凝集，可在血清中加一滴洗涤过而不稀释的鸡红细胞，摇匀，室温放置2h，然后低速离心去除红细胞。如非特异性除去不全，可重复处理。

2．白陶土处理法。

白陶土处理：白陶土又称高岭土(Kaoline)，商品白陶土(实验试剂)必须经处理后方能应用。

(1)取白陶土25g加水至100ml。

(2)加入0．1mol／lHCl250ml，摇匀后静置1h。

(3)用布氏漏斗抽滤除水。

(4)用去离子水反复洗涤使成中性(约10余次)。

(5)倒去上清液，摇匀，2000r／min离心10min。

(6)移入清洁平皿内。

(7)置37℃温箱内烘干。

(8)用pH7．2PBS配成25%悬液，置4℃保存待用。

血清处理 应在试验前一天进行。

(1)取血清0．1ml加25%白陶土0．5ml。

(2)振荡混匀，置37℃1h或40℃过夜。

(3)加pH9．0BHS0．5ml，混匀，2000r／min离心5min。

(4)取上清，56℃灭活30min。

(5)加浓红细胞0．05ml，混匀，37℃水浴20～30min。

(6)3000r／min离心10min，取上清液即为1∶10的待试血清。

pH9．0BHS的配法如下。

取0．5mol／1H₃BO₄100ml、1．5mol／lNaCl80ml、1．0mol／lNaOH24ml加去离子水至1000ml。

二、猪流感病毒(Swine influenza virus)

猪流感的病原为甲型流感病毒，其表面抗原组成为H₁N₁(HSW-1N₁)。主要经呼吸道感染，传播迅速。有猪流感嗜血杆菌合併感染时病情往往加剧，乳猪被感染可能死亡。被认为猪流感病毒能引起人流感，这种关系受到人们的重视。

(一)样品采集 用灭菌棉拭取鼻分泌物。也可扑杀急性病病猪，采脾、肝和肺淋巴结等供作病毒分离。采双份血清供作血凝抑制试验。

(二)实验室诊断 用鸡胚培养分离病毒。用血凝抑制试验或中和试验检测发病期和康复期的血清。详见马流感病毒。

三、禽流感病毒(Avian influenza virus)

禽流感病毒的表面抗原分为10种不同的血凝素(H₃、H₄、H₅……H₁₂)和5种不同的神经氨酸酶(N₃、N₄、N₅、N₆、N₉)，它们以不同组合配对。本病毒对多种禽类(鸡、火鸡、珠鸡、野鸡、鸭、鹌鹑、鹧鸪、燕鸥、鸽和鹅等)有致病性。

(一)鸭流感病毒(Duck inf luenza virus) 鸭流感发病率高，但死亡率低，病鸭的主要临床症状为眶下窦肿胀。因呼吸困难而死。揣测鸭流感与人流感可能有关。

1．样本采集 采肝、气管、脾、肝分离病毒。采双份血清检查抗体。

2．病毒分离 鸡胚接种时鸡胚于感染后60h至5天之间死亡，收获尿囊液检查病毒。若接种后第5天仍存活，除取尿囊液检查病毒外，并进行盲传。

3．血清学试验 用血凝抑制试验和中和试验鉴定病毒和检测抗体。

(二)鸡流感病毒(Fowl plague virus) 鸡流感病毒即鸡瘟病毒(FPV)，鸡流感的临床症状和病理变化都难以同新城疫相区别。

1．标本采集 用灭菌棉拭从呼吸道和窦部采集渗出物，从泄殖腔采集粪便和采脑、脾、肺供分离病毒。分离血清检测抗体。

2．实验室诊断 同新城疫病毒。

鸡流感病毒与新城疫病毒的鉴别诊断 可用交叉血凝抑制试验，用鸡胚进行中和试验和雏鸡免疫保护试验进行鉴别。