样品数量和制备技术
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《农作物品种鉴定手册》第140页（5735字）
1．样品数量 一般说来，电泳用种子数量要求在经济和可靠的前提下，应尽可能缩小。按此原则，品种真实性鉴定每个样品取3－5粒种子的重复。也即每个样品只用3－5粒种子、幼苗或叶片部分，并应有标准样品作对照。但品种纯度测定与样品纯度有关。品种纯度愈高，要求电泳种子数量愈多。从统计学观点看，一般样品数量越多，统计数与总体参数之差就越小。但在实际工作中，只要误差在允许范围内，样品粒数要尽可能缩小，否则工作量太大。因此纯度测定的最适取样数量取决于所要求的概率水平和样品的实际品种纯度(表11－4)。从表11－3可以看到，如果品种混杂率为5%，要求测定结果达到概率水平0．95，则测定58粒种子就可以。但在实际应用时，最好先取500粒代表性样品，然后随机从中数取58粒进行预测。如果预测结果纯度在90%－95%之间就可不再测定。如果预测结果纯度在95%以上，应再测58粒种子，求出两次结果的平均值。
表11－4 不同混杂率和概率水平所需测定的种子样品数量
2．样品制备 电泳用种子、幼苗或植株部分的蛋白质或酶的提取液要求清洁，含有足够的浓度，并且要便于微量进样器吸取和加样，达到电泳谱带清晰。
一般含油脂低的胚、胚芽，如水稻种胚和萌动胚芽，可用含有20%蔗糖的电极缓冲液提取，但需注意，取胚时，尽量少带胚乳，并在研磨时充分磨成匀浆，以保证有足够的蛋白质或酶溶解出来，并防止损失。若用整粒种子或整个幼苗或叶片等，则需用有关适用的缓冲液进行研磨，离心(8000－12000转／分)15－20分钟，吸取上清液进行电泳。
若用含油脂高的种子电泳时，需用丙酮或醋酸乙酯进行脱脂。可用10份干冰与种子混合研磨，过筛(200μm)，然后将粉用丙酮洗涤2次或用醋酸乙酯冲洗，再放在通风干燥处。最后每份粉加5份Tris－硼缓冲液(pH8．9)或其他缓冲液进行研磨，提取蛋白质或酶。
3．样品中蛋白质含量的快速估测(斑点测定) 电泳前，应对样品中的蛋白质含量进行快速估测，以确保电泳谱带的明显。这里引H．Stegemann介绍的方法摘录如下。
按样品提取方法提取出样品蛋白质提取液，吸取5μl点在层析纸上，并用吹风机吹干，然后将该层析纸放入20%三氯醋酸液中浸2分钟，马上用水漂洗，再放入0．25%考马斯亮蓝染色液中染色5分钟，最后放入胶色液〔水∶甲醇∶醋酸=28∶12∶2(v／v／v)〕进行脱色，直至蛋白质斑点明显，背景褪回淡蓝色为止(每次10分钟，脱色2次)。
为了估计蛋白质含量，可用0．5、1．0、1．5……5μg／5μl血清蛋白作标准与斑点进行比较，确定样品中蛋白质含量。
当样品含盐多时，可用尿素去污剂或有机溶剂来清除。
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