影响体细胞胚胎发生的因素分析

出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第44页（10406字）

表2-1到表2-5列出了适合于不同植物特定培养方法。体细胞胚的发育通常是在缺乏生长素或生长素含量降低的培养基，或者在活力较弱的生长素的培养上进行。然而有一些植物，特别是牧草体细胞胚的启动和成熟均发生在第一培养基上，但是对于这些胚再生成植株来讲，转移到第二培养基则是需要的。根据经验，从表上可以看到，每一个种各自有一个适宜它的培养方式。下面我们将讨论在组织培养中影响体细胞胚的启动和成熟的变量，以此来发展一些基本概念，这些概念也许会有助于去解决那些至今还未能产生体细胞胚植物种的胚启动问题，和那些能胚启动植物种的成熟过程调控问题。

(一)外植体

最适用于植物组织培养的胡萝卜，它的任何部分以及不管它处于什么发育生长阶段，都能够经组织培养过程产生体细胞胚，例如胚、下胚轴、幼根、主根、叶柄、花序梗组织、原生质体。

某些植物只有某些区段在组织培养中有反应，许多单子叶植物尤其是禾本科成员的情况更是如此。这些植物的活跃分裂细胞区段似乎容易发生反应，下述植物未成熟的胚极适于培养，如牧草(雀麦属和黑麦草属)，和禾谷类植物(狼尾草属、黍属、小麦属和玉蜀黍属)。多数试验证明离体胚在第一培养基上有一个临界定向问题，即胚的“根—叶”轴必需贴住培养基——“脸向下”姿态。所以盾片似乎是一种具有特别反应能力的组织。如果在麦类植物开花后不久，立即喷施一些2，4-D，那么它所结的种子长出植株将会是多蘖的，组织学研究表明这些分蘖来源于一些不定胚，而这些不定胚产生于合子胚的盾片上。

禾谷类的胚胎发生培养也能以幼嫩的营养器官作培养物。例如珍珠粟和芦粟的第3-4片幼叶的基部5-8cm。粟和芦粟的幼小花序，也是一种适宜的培养材料。

一般说来，花组织或生殖组织也是一种用作胚胎发生培养的好材料，例如胚珠(番木瓜、柑桔属、日本泡桐、葡萄)和花梗(Carica stipulata)，但对萱草属来说宁可取未成熟的子房。

常春藤是一种具有清楚的幼年一成年期发育进程的植物，它只能从成年期材料上培养出体细胞胚。简单地讲，胚性组织、分生组织、生殖器官组织似乎存在着一种胚胎发生生长的习性。

外植体的植株生理状态也是极为重要的，因为它会因生长季节而丧失胚胎发生能力。

体细胞胚可以从单倍性的小孢子诱导，也可从两倍、三倍、多倍性体细胞和三倍性胚乳组织诱导。培养物的基本倍性水平似乎并不影响它们的细胞通过体细胞胚胎发生的能力，然而已建立的培养体倍性水平会影响体细胞胚发生。

在某些植物种中，不同的基因型有着不同的体细胞胚胎发生能力，例如紫苜蓿、红车轴草、胡萝卜。玉米的三个栽培品种可以进行有叶器官建成的培养，仅有一个品种(A188)较容易产生体细胞胚。最近，Lu等人(1982)报道了从玉米的12个基因型的组织培养中都获得了体细胞胚，但这些基因型之间的体细胞胚胎发生频率有着显着的差异。

(二)培养基

体细胞胚可以在从浓度相当稀的White培养基到浓度相当高的Gamborg等(1968)、Schenk和Hildebrandt(1972)、Murashige和Skoog(1962)的培养基上生长。B₅，SH，MS培养基是属于高浓度无机盐类型培养基，特别是MS培养基，它的无机盐浓度大约是White培养的10倍。将上述培养基用作于农作物胚胎发生培养时，Evans等(1981)注意到有70%的植物体能在MS或改良MS培养基上进行培养。培养基的选择能影响胚胎发生培养效果。Mouras和Lutz(1980)在肯定“强”无机盐对胚生长的益处时，同时强调“弱”无机盐能保持胚胎发生悬浮体的潜力。

MS培养基中的关键元素是以高浓度硝酸胺形式存在的氮，至少在胡萝卜的体细胞胚培养中，可以高浓度的硝酸盐形式满足无机氮的需求。减少培养基中除硝酸盐之外的氮素量对于胚的启动和成熟都是有益的，由于White培养基中硝态氮含量特别低而无还原氮，因此，为了维持持续的胚胎发生需要补充适当的氮素。体细胞胚胎发生培养中最适氮素供应的形式似乎与生长素浓度有关。

还原氮的来源有以下几种：1)复合附加物，如CW或CH；2)氨基酸混合物；3)单个氨基酸，例如L-谷氨酸或L-丙氨酸；4)铵态氮。在所有这些情况下培养基中都含有硝酸盐。然而，有时，铵态氮也能够作为一种唯一氮源。在所有的氨基酸中，L-谷氨酰胺似乎担负着一种特殊作用，在逐一添加氨基酸的对比试验中，谷氨酰胺最容易诱导产生胡萝卜体细胞胚。甚至将谷氨酰胺加到早已加有铵态氮的还原氮(以此减少氮量)的培养基上，植物体细胞胚的诱导也是有益的，例如棉属、番木瓜和薯蓣属。

在植物组织培养中培养基中钾离子对体细胞胚胎发生是必需的。在低氮素水平的情况下，不适当钾离子浓度的影响特别明显。

MS培养基和其它类型培养基中铁盐也是影响体细胞胚胎发生的一个重要元素。一般是以螯合态铁即EDTA螯合铁盐存在于培养基中。在胚胎发生的花药培养中，以EDTA螯合型铁盐的培养效果为好。在缺铁情况下，胚不能从球形期发育成心形期。在普通烟草和颠茄的花粉胚培养中被观察到这种现象，在后一种情况下，影响“胚”发育“时期”，已诱发球形胚，在无铁培养基上被阻止，当恢复铁盐时，就开始胚的成熟。

(三)生长调节剂

1．生长素 橙或枸骨叶冬青等可以在无外源生长调节剂的培养基上产生体细胞胚。这是具有先天胚胎发生能力细胞存在的最好例子。培养来自分化组织的培养物，植物生长调节剂特别是生长素或生长素与细胞分裂素组合对其生长的启动，胚胎发生的诱导是必不可少的。

有些植物可在一系列不同的生长素配制的各种培养基上进行胚胎发生培养，例如，胡萝卜胚胎发生培养可在含NAA、2，4-D和IAA的培养基上进行。但是，有一些植物对生长素的要求有选择性，例如，在珍珠粟组织培养中，也包括其它禾谷类植物和牧草植物，只有2，4-D是有效的。所有的生长素或类生长素中，2，4-D被证明是极其有效的，大约占成功的体细胞胚胎发生培养总数的57%。一些非常用的生长素也成功地用于胚诱导，例如α-苯并噻唑乙酸(BTOA)用于印度娃儿藤，对氯苯氧基乙酸(pCPA)用于大蒜，Picloram用于红车轴草。

从表2-1至2-5中可以发现，第一培养基的生长素类型可以和第二培养基的一样，也可以不一样；在同一培养基上可以含有一种生长素或者若干种生长素，多数培养试验证明，在培养过程中变换生长素的类型或浓度是体细胞胚发育的前提条件。

2，4-D和NAA的有效浓度范围分别是0．5—27．6μM和0．5—10．7μM。高浓度的生长素对某些植物也有作用，如椰枣使用2，4-D452μM。不同基因型的苜蓿属各自有一个特定的适宜生长素浓度，遗憾的是，生长调节剂的浓度都需要依靠经验决定。

2．细胞分裂素 从表2-1至2-5可以看到细胞分裂素对于许多植物的胚培养是很重要的。Evans等报道(1981)，在第一培养基中有65．4%的农作物和21．4%非农作物胚培养都使用了细胞分裂素，在第二培养基中有34．6%农作物和14．1%非农作物使用了细胞分裂素。KIN的有效浓度范围是0．5—5μM。细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显着作用，特别有利于子叶的发育。对于细胞分裂素的需要可能是专一性的，例如只有ZEA能促进胡萝卜体细胞胚胎发生过程，而BA，KIN无促进作用，有时，细胞分裂素对于胚生长成植株是有帮助的。此外，细胞分裂素在低密度培养中显得特别有效。

3．赤霉素 赤霉素基本上不在第一培养基上使用。但在檀香、柑桔、珍珠粟、玉米胚培养中，赤霉素对于胚成熟、发根和次生生长都是有益的，GA₃与ZEA、ABA配合使用，可以促进蒿体细胞胚的正常发育。在花菱草的培养中，使用GA₃可解除其体细胞胚的休眠。

4．组合与顺序处理 有许多例子证明，植物生长调节剂的配合使用有助于胚的启动和生长，促进体细胞胚发育。在蒿的培养中，可以通过变化ZEA、GA₃、ABA三者之间的水平例调节正常发育。

培养基和生长调节剂顺序是同等重要的。很多植物的胚培养过程分别在三种培养基上进行，第一培养基上启动愈伤组织发生并维持愈伤组织或悬浮培养物的增殖；第三培养基上再生成植株。从日益增多的培养试验中表明，胚培养过程需要一种较复杂的培养基顺序变化，在人参培养中，初始培养的启动，启动后的维持，体细胞胚发育的启动，胚的增殖，成熟过程的刺激，各个步骤都需要不同的培养基。在萱草属培养中，变化生长调节剂、椰乳、各种无机盐溶液顺序以用于产生体细胞胚和再生植株。对于那些至今还难以产生体细胞胚的培养体，寻找出一个合理的培养基顺序是必须的。

(四)生命抑制剂

1．脱落酸 抑制剂特别是ABA，在体细胞胚胎发生过程中的作用正逐渐地被揭示出来。ABA是一种天然产生的生长调节剂。当把无抑制作用剂量(通常是0．1-1μM)的ABA用于和兰芹属培养物时，可以允许胚成熟过程进行，但是(1)抑制异常增殖，包括不定胚的启动，(2)抑制早熟萌发。正常的双子叶胚，它类似于合子胚。以后在胡萝卜培养中也观察到ABA限制胚启动的效应。还看到ABA在胡萝卜和美国狼尾草胚成熟时的正常效应。ABA促进柑桔胚珠愈伤组织培养体的体细胞胚的发育。

在花药培养上，Nitsch(1969)观察到ABA不抑制由普通烟草小孢子形成的胚的发育，但是抑制其萌发。Imamura等(1980)指出，接种前预先将花药在ABA中浸泡三天，可以提高培养成功率。

在离体合子胚的培养中观察到ABA的上述效应。Ihle等(1972)曾报道一种ABA抑制大麦离体合子胚的早熟萌发的效应。相似的效应在棉花离体合子胚上也被观察到，大麦离体幼胚可以在含ABA的培养基上不经过愈伤组织而直接完成胚的正常发育。

2．抗生长素 5-羟硝基溴化物和7-吖吲哚促进柑桔培养物的体细胞胚发育。Fujimura等(1976)报道，抗生长素(2，4，6-三氯苯氧基醋酸和对一氯苯异丁酸)抑制体细胞胚发生，这种抑制效应，发生在胚胎发生的早期阶段，因为处于这个阶段的幼胚对培养基中的生长素敏感。

8一吖鸟嘌呤(AG)，它是一种细胞分裂素活力的抑制剂，在柑桔的组织培养中能促进体细胞胚的发育。当将8-AG作用于蒿体细胞胚时，能促进体细胞胚的成熟，但抑制愈伤组织和再生胚的形成，表现出一种类似于ABA的效应。

在胚胎发生培养物中发现了生长促进剂，尽管它不是被加到培养基中去的。ABA、抗生长素和其它的生长抑制剂促进体细胞胚成熟也许是通过颉颃生长促进剂而起作用的。通常当体细胞胚不能成熟时，把它们加入培养基中，就可完成体细胞胚的成熟过程。

(五)活性炭

在培养基中添加活性炭有利于体细胞胚的发育，这在许多培养中得到证实。其中包括椰枣和Carica stipulata的组织培养。活性炭有助于胡萝卜体细胞胚的发育，甚至在不用生长素不能产生体细胞胚的那种培养中，添加活性炭就会有助于体细胞胚的形成。在洋长春藤组织培养中，只有在培养基中含有活性炭时，来自成熟茎的愈伤组织才能发育成胚，反之，只发生未分化态愈伤组织的增殖，活性炭在花药培养中也具有显着作用。

产生这种效应的原因大体上是加入活性炭降低培养基中苯乙酸和对-羟苯甲酸等抑制剂的水平。活性炭能吸附5-羟甲基糠醛(一种由蔗糖在高温高压消毒中分解形成的抑制剂)、生长素和细胞分裂素。所以，活性炭既可吸收抑制胚生长的这些抑制剂，也可降低生长促进剂的水平，从而能保持持续增殖生长。但是，活性炭也会吸收某些铁螯合物，即Fe·EGTA和Fe·EDDHA，从而抑制了球形胚向心脏形胚的发育。但无证据表明活性炭会吸收Fe·EDTA。

(六)糖类

虽然很多单糖和双糖都能成功地用于胚培养，但蔗糖是体细胞胚胎发生最有效的还原碳源。在某些情况下，一些糖的培养效果优于蔗糖。在培养中，高浓度的葡萄糖(6-10%)有利于一个胡萝卜系的体细胞胚发育。半乳糖促进柑桔胚珠的愈伤组织的体细胞胚的发育。变化糖类也许是有益的，如Shamouti橙未胚胎发生的珠心愈伤组织先在不含蔗糖的培养基上培养四个星期，然后将这种愈伤组织转移到含蔗糖的培养基上培养促进了体细胞胚胎发生。

第一培养基中的蔗糖浓度提高到12%有利于玉米幼胚盾片培养物胚性愈伤组织的形成。在胡萝卜和Sium suave体细胞胚培养中，随着增加蔗糖浓度，抑制了早熟萌发在高浓度的己糖醇(例肌醇、山梨醇)情况下类似的反应。蔗糖和己糖醇的浓度增高，会提高培养基的渗透浓度。不幸的是，在这种条件下，会沿着它们的轴发生大量附属不定胚。在暗培养下通过增加肌醇量，而相应地降低蔗糖量，可以使胡萝卜的体细胞胚成熟，而无额外增殖和过早萌发。

在紫苜蓿的组织培养中，添加可溶性淀粉可以促进胚的生长，但抑制增殖成愈伤组织，并且使得单个细胞和松散细胞团老化。维生素降低到正常浓度范围的¹／₁₀也有类似的反应。从这些现象可以导出一种假设，即淀粉表面吸附了这些分子，从而降低了激素和维生素在愈伤组织化过程中的效力。

(七)环境因子

1．光 在一系列的光暗条件下，都能产生体细胞胚。普通烟草的胚培养中，其体细胞胚的形成是需要高光照。而胡萝卜属的胚培养中，能在完全黑暗的条件下，完成较正常的胚成熟。Newcomb等(1970)发现远红光的短时间照射可以促进体细胞胚发生。

2．温度 在体细胞胚胎发生培养中温度效应的研究工作做得很少，尤其是低温处理研究，而在花粉胚诱导培养中证明低温处理是有价值的。在柑桔属愈伤组织诱导培养中，随着培养温度从27℃降到12℃，胚胎发生能力随之下降。花菱草属体细胞胚的冷处理，可部分地解除固有休眠。

(八)培养容器和培养基状态

较早的报道指出体细胞胚胎发生可以从生长在半固体培养基和液体悬浮培养基的愈伤组织培养体上产生。这种现象表明体细胞胚的培养可以从液体到半固体范围内的培养基上进行。体细胞胚在半固体培养基上可以有二种状态，一是嵌在培养基中，二是贴在培养基上。半固体培养基可以盛装在瓶或罐容器内。盛装培养基的容器需要用塞子或盖子封闭，封闭的程度可以分为二种：一是可以进行必要的气体交换；二是全封闭，不使气体进行交换。体细胞胚可以在下述几种液体培养方式中发育：1)装有培养液的牛奶瓶进行缓慢的旋转，2)装有培养液的管子进行滚动，3)装有培养液的锥形瓶放在转动摇动器上，4)盛有培养液的试管沿着它们的纵轴进行旋转。体细胞胚也可以在与培养液相接触的滤纸桥上形成。

一般认为，培养器种类、胚在培养基中的姿态(浸入培养基或浮在培养基上)和培养基的物理状态(半固体或液体，通气性好坏)对胚的形成和发育影响很小。然而，在蒿体细胞胚培养研究中，培养的方式影响着胚成熟体细胞胚群体的生长情况是在三种容器分别盛装相同数量，相同类型的培养基上发生的。盛有培养液的锥形瓶放在滚动摇动器上的培养(在这种转动器上可以使培养液充分混搅，充分交换气体)所产生的体细胞胚的生长显得更异常。相反，在滚动管中的体细胞胚的生长就显得比较正常，在这种培养条件下，培养液的搅混缓和且通气。在呈连续浸没态培养的试管中的培养体只发生极少的异常增殖，子叶发育极差。但是，只要培养液中含有ABA，正常的胚成熟就会在所有的三类培养容器中发生，即培养瓶、滚动管、试管。

(九)气体

培养容器或溶解在培养基中的气体效应的研究很少。Kessel等(1972)指出，低于临界水准的溶解态氧的水平有利于胚胎发生，而较高溶解态氧水平则有利于愈伤组织和根的发育。最近研究表明在低氧培养体中的腺苷水平增高。

Tisserat等(1977)报道乙醇和乙烯在柑桔属和胡萝卜属的胚培养中，抑制体细胞胚的发育，而Kochba等(1978)报道，乙醇和乙烯对柑桔属培养物的刺激作用，由于它释放乙烯，Dunwell(1979)在烟草小孢子培养中发现，培养容器中的一种微量气体会抑制体细胞胚的发育，并探索到这种气体的一部分是乙烯。Imamura等(1980)证实，作为一种预处理，将花药置于一种减压状态下，能够提高花粉胚数量。Rajasekhar等(1971)报道的一些论据表明，在低氧的悬浮培养条件下积累了一种不明的易挥发的细胞分裂抑制剂。显然，各种气体的可利用性、吸收性、释放性、分解性都能影响体细胞胚胎发生，奇怪的是，这方面的研究却很少。

(十)密度

Halpcrin(1967)报道了在悬浮培养液中胚胎发生细胞的密度和胚成熟度之间的一种直接关系。这种对密度的反应已在细胞培养中多次观察到。通过使用条件培养基，可以获得低于“最小有效密度”的体细胞胚生长。由裸大麦花药或子房条件化了的培养基，在花药培养中，提高了花粉胚的产量。如果在培养基中附加生长调节剂和氨基酸，悬浮培养体有时能在低于“最低有效密度”条件下生长。最近的研究表明，当蒿体细胞胚生长在低密度条件下，适当浓度的ZEA和ABA的应用，能调节促进体细胞胚成熟。如果试图通过过筛和离心的方法剧烈地减少群体密度，以此得到一种群体，那么低密度的影响会是非常关键性的。

(十一)同步性

体细胞胚群体独特地显示了形式多样的形态和发育阶段。这是因为①从维持培养基转移到促进发育培养基的时候，存在着多样化的原胚细胞群，这些细胞群是由几个细胞到较多细胞组成。②在某种程度上，体细胞胚胎发生是反复进行的(这种反复性在种与种之间是不同的)，这样，新的胚胎发生中心就会从原胚细胞群中或是从成熟的胚中产生。使得所有的胚整齐地通过每一个发育阶段，这无论是对于理论研究(如生化分析等)，都有极重要的价值。想要做到这种一致性，就必须着手解决两个问题，一是提高接种物的均匀性，二是抑制额外(次生)胚的产生。

达到某种均匀程度的最常用的方法是在转移到第二培养基的时候，借助于过筛手段。这样，至少也能使得开始时的群体均匀。一系列规格的不锈钢网筛或尼龙网筛可以完成这种过筛工作。将悬浮培养液在玻璃球之间通过也是一种有效的办法。通过在含2%蔗糖的16%Ficoll溶液中的离心过滤能分离胡萝卜属细胞群体，每一个这种群体大约聚集有3-10个细胞；当把这种分离物移至无生长调节剂的培养基上，即可同步发育。

已证明ABA控制蒿和珍珠粟的“重复胚胎发生”是有效的。

(十二)遗传稳定性

早已注意到培养体倍数性水平的变化，这种变化常导致产生多倍体和非整倍体的混合群体，由这类培养体所产生的再生植株往往具有一系列的染色体组型。培养体的胚胎发生能力会随着继代培养代数的延伸而逐代减弱，以至最后丧失。至少在某些实验中，上述现象被归结为由染色体组的变化所导致的，这种染色体组分的变化使得非整倍体细胞逐步地在逐代培养中取代二倍体细胞。

这种胚胎发生能力的减弱现象，也许是可以改变的。常规的甜橙培养中，可以通过去掉蔗糖或是使组织老化的手段恢复胚胎发生能力。通过在继代培养的每一代中变化生长调节剂，使一个丧失胚胎发生能力的胡萝卜系逐步恢复了胚胎发生能力。还不十分清楚，这到底是由于悬浮培养液中的具有胚胎发生能力少数细胞的选择性增加，还是由于少数后生遗传上改变的细胞再诱导的结果。然而，已证明，作为培养的细胞发生了染色体的遗传和后生遗传的变化。

虽然一些胡萝卜属悬浮细胞存在范围较广泛的染色体变异，而再生植株几乎都是二倍体。当时的分析是，只有染色体组分未变异的细胞才能发育成为体细胞胚和再生成植株。然而长期胡萝卜胚培养中的体细胞胚胎发生能力的研究表明，体细胞胚和再生植株能够形成，但它们大部分是不育的。在萱草属体细胞胚和再生植株上观察到染色体核型变化，而不是组分变化。在无芒雀麦的胚培养中，由体细胞胚所产生的植株为白化体。在多花黑麦草胚培养中，50%以上的再生植株为白化体。如果想通过体细胞胚胎发生途径最终繁育出无性系，那么染色体和遗传的完整性将是十分重要的。一系列的有关研究表明，在细胞培养中，频繁地对培养物进行继代培养能够有效地使染色体变化程度降低，Knikovian(1982)报道，继代培养不到一年的悬浮培养体。由它的体细胞胚发育而成的胡萝卜植株的表型是正常的。这样对培养体一开始就保持新鲜培养和进行适当的继代培养就有可能保持遗传和染色体的稳定。另外，天然产生的体细胞无性系似乎对生产新奇而有价值的品种有巨大的潜在能力，如同马铃薯原生质体诱导所形成的植株上出现的情形一样。

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