多年生木本植物的改良
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第214页（7945字）
现已发掘出用前所不能的方法研究树木遗传。细胞和组织培养能以大量繁殖优良树种。体细胞无性变异和重组DNA技术可直接改良未来森林和果园树的特性。
树木细胞和组织培养为首的问题是外植体源。其主要问题是外植体的残留回忆，叫“Mnene”记忆。它反映着整株上细胞的发育历史的综合。采用适当营养和植物生长调节剂能保持外植体的生存力，和表达器官建成。外植体的生长和发育还不能予测和控制，基本上以其大小、位置、生长模式、年龄、微观环境和全能性为准选择外植体源。这些变数翻译成最适合的“生理状态”，表示在细胞的倍数性，生命形式和营养繁殖。具体表达在许多明确的特征，如：基因型倍数性和杂合性、年龄、组成细胞数(子细胞分裂)、组成间的联合，营养吸收、生长调节剂反应，氧化还原状态、和细胞周期的中止。诸因子的任何组合认为是外植体“状态”。营养繁殖的成败，受幼年性和成年性生理状态的影响。
树木种的特点是生命周期长，内部相关强、生理状态复杂，与环境变化很好协调。从组织和细胞培养出发，需要童化或复壮个体。典型化和获得遗传。
(一)繁殖和利用循环
无性循环目的在于改良树木种质——遗传基础。生命周期是由细胞循环和其核-质互作，当与生命循环相联合时，产生着幼年组织与全能性细胞，取得营养繁殖和无配子生殖、获得遗传优性。稳定的典型化，有赖于细胞决定的核-质循环中后生遗传因子。营养繁殖和基因克隆用二个亚循环表示，为繁殖提供特殊要求。微繁殖和体细胞胚胎发生，育种家可由此获得加性和非加性基因表达。生物技术学期望做到材料(基因)置换、转化和相互转移。整合这些过程对农业革新尤为重要。
(二)优良特性的生化和生理学标志
充分评价特性的自然变异，必需了解亲树种的行为。多年生树木需要多年观察。现己处在用细胞和组织和遗传工程改变树木遗传构成的大量繁殖阶段。最近十年来，已从树木和果树和农业森林系统中，建立了优性大量克隆繁殖树种。细胞和生命周期内优性表达主要有幼年性、成年性、畸变和典型化问题。
(三)细胞和组织培养成果
十年来着重研究微繁殖难插枝生根种的体细胞无性系幼树。与群体遗传学相比，细胞和组织培养的优点是：具有加性和非加性特征的遗传性状，经全能性表达能形成无性系；保存已建立基因组的杂合性；采用改进的营养培养基和合成生长素和细胞分裂素，从幼年或复壮外植体在无菌条件下常规诱导生芽和根。这样避开愈伤组织的微繁殖，偶有新和出于期望的变异性(有用或畸变)出现。
美国农业部(1971)估计一些种组织培养取得的成就(表10-6)。Hall(1980)指出火炬松改良母株第一代每年每英亩产木材120-190立方呎。克隆化能提高生产力3．7倍。若取得目标产量25-30M3／ha／年应采取3种策略：1．种子圃中控制杂交繁殖以获纯合种子后代；2．用优选树较老组织使之童化建立细胞无性系；3．将幼年组织深冻贮藏，直至经后代试验选出优良种质。
表10-6 在加强森林管理术体系下，改进树种选育第一代取得的遗传改良及其效果
果树方面，育成矮化树，可节省整修，间拔和施肥工时，尤其是采用在树上移动收获和治虫机械。缩短结果年限，便于果园更新。
草莓已成为采用这种原理的多年生习性植物的好典型。通过选择和栽培措施，其多年生产果习性成为一年生性。由此在30年来每英亩产果量从1t增高到30t。长达超过50t。分生组织培养产生草莓植株年增产26%。但常有很多未可预见的变异性，应加以选择培育。Durzan等(1975)取得了美洲榆细胞悬浮培养体再生成功。最近研究涉及细胞悬浮体的体细胞胚胎发生问题。Rao(1984)报道了檀香原生质体的体细胞胚胎发生。
(四)外植体性质对组织培育的影响
树木种的组织培养的实际问题是：1．获得遗传如何能增高生根潜势?2．如何控制幼年期早或晚开花，早开花结实早，晚开花增加产材量?3．如何开发农业森林和园艺品种幼年和成年阶段的繁殖体的生长和形态的变异性?细胞决定的核-质循环和细胞循环决定着幼年性和上述的解答。微繁殖在于改变或避免成年植株的阶段发育，由此，个体细胞转化到适于营养繁殖或开花的生理状态。可见生物学水平上许多因素影响着外植体选择。
外植体的发育表达的控制，一般认为是“许可的”或“诱导的”，或以“直接”和“间接”表示。多年生树木同株的不同部位有的倾向于保持幼年，其它保持成年。切取外植体部位有重要性。这种位置效应叫Topophysis，表现外植体记牢其部位，并继续表达这种部位的潜在特性。另一反应叫Cyclophysis，其表现状态与外植体的发育时期有关。第三叫periphysis，部位和发育年龄相同的外植体受微环境(例如干旱、遮荫)差异而造成。森林学家把来源于原始幼苗的组织叫无性系母株(ortet)，把营养生长后代叫ramet。随着营养繁殖增多，成功阶段表达特性更趋稳定。同一株树木作为发育的和生理学的梯级的函数，可同时存在幼年和成年组织。有些组织可能具有无性传递特性或后生小境，一旦发生这种变异，即使原有刺激因素不存在时，能通过克隆化而保持。减数分裂细胞可回复后生变迁，表现强烈发育倾向，变为高度童化组织。
继续营养繁殖产生一群植株叫无性系也可叫栽培品种，它能由幼年或成年外植体产生。有时用topoclone，cycloclone和periclone加以区别。Mericlone指来源于分生组织的细胞无性系。
无配子生殖是不经减数分裂和受精产生种子的循环过程，极少情况下，在细胞团内部生长单个类分生组织，象胞子一样破团而出。最近发现在细胞和组织培养系统内能重复无配子生殖形成离体培养体细胞胚或人造种子。
原生质体技术及其表达全能性，是另一主要发展。卵本身实质上是原生质体。松柏种子常有单倍体母性细胞。经原生质体融合，能构成含有单核体核的杂种原生质体，具有一系列纯合到杂合核。固定其纯合性或杂合性，可能影响着这些多细胞原生质体如何变成复壮的和重演的体细胞胚胎发生。
(五)如何选择外植体源
遗传同一性、稳定性和性能是挑选外植体源的主要问题。鉴别遗传状态的因素：1．建立母株的遗传同一性，即证明其可遗传性质和性状传递方式，2．采用营养体后代测验园艺的和遗传实质；3．保持外植体源的同一性，由此追查任一繁殖阶段发生的变异体；4．反常代谢产物，贮藏物质和细胞状态或阈值的鉴别和数据化，表征着发育的遗传稳定性或不稳定性。对具有特定获得遗传的当选外植体需加特化诊断测验，单克隆抗性是适用技术之一。实验室测验是最直接和关键测验，由于：(1)可评价特定营养培养基对生长和发育的效应；(2)可调节营养物、生长调节剂和其组合到阈值之上或下；(3)取得再生植株，可产生资料供经济分析；(4)可评价污染、遗传学和生长调节剂等营养的和环境效应；和5证实有关于外植体选择的假说。
选择外植体应考虑：(1)取得获得遗传(例如生长率和抗病性)及其代谢基础。幼年组织在特定环境下倾向于具有按规定模式重建器官和生物体。成年组织很快出现成年发育状态和次生特性。代谢不同应与这些器官建成倾向有相关。(2)外植体行为。应考虑环境、本身表面一体积大小和极性。(3)应找出外植体具有专化功能的细胞，它们能以复壮，尤其是自身调节形成新分生组织。这些外植体常存在过去发育和未来作用间密切关系，如已成为胚胎发生性细胞，易于表达体细胞胚胎发生。
外植体大小和供体与外植体的复杂性，应以细胞遗传学，细胞数、大小、表面和体积为依据加以解释。例如松柏(Douglas fir，火炬松)外植体或悬浮培养体的核和细胞比野生胡萝卜的至少大10倍，影响着接种密度，有时产生未可期望的效果。
外植体部位，应识别细胞生长的潜在组织模式，这是可能是外植体原有的或细胞悬浮体中产生的。如火炬松在MS+25μM NOAA+0．44μM BAP影响下，从3月龄茎表面(皮层和亚皮层)细胞产生子细胞群内，形成球囊状愈伤组织，有大而明显核。在11．0μM NAA+0．9lμM玉米素和2，4一D子细胞形成高度液泡化的薄壁细胞。又如Douglas fir2周龄子叶培养在MS+25μM NOAA+0．4μM BAP，在薄壁细胞间形成球囊，以后发育成形成层状细胞的同心环，中心先发维管束。在同样条件下，从另一外植体，在皮层下形成类分生组织，长成不定芽和维管束状组织。来源外植体中，这种模式的细胞，可取出独立建立培养体。外植体接触培养基的部位也重要，尤其对生长素运转和营养分的定向供给。这些因素与自然胚胎发育相符，应在新环境下予以测验。
识别发育模式，细胞的早期发育模式，可用遗传同一细胞悬浮体观察鉴别。组织成胚或芽的细胞，开始时可见几种类型。(1)产生愈伤组织或败育结构，常见染色体不稳定发育模式变化很多；(2)分化成极性和对称状态细胞团，尤其是在母细胞壁内分裂的，只有少数变异。随之顺序发育成高度有组织的阶段(球形、心形、鱼雷形胚)。识别发育模式，要在区别无配子和有性生殖过程。与童化有关的无配子发育是形成球芽。由此产生的不定芽可用于成年果树的营养繁殖。严格除芽可诱导球囊。Douglas fir2年龄侧枝顶盖愈伤组织，培养在MS+25μM NOAA+0．44μM BAP，经7个月继代后，转移到1／4MS，不加硝酸盐，加L一天门冬氨酸十生长调节剂和琼脂，经每周继代4次后，用孔径63-279μm收集悬浮体细胞，再悬浮在不加生长调节剂的同样培养基上。新培养基加4．5ppm泛酸钙+0．5%(v／v)Douglas fir种子水提取液。2个月后，将球形球囊转移到1／2MS+0．1M甘油+14．6mM蔗糖。5周后切片观察可见球囊。另外白虎尾枞1周龄下胚轴(不含顶端分生组织)愈伤组织产生球囊，培养在Ducan等(1973)培养基上，3月后悬浮培养体生根，长1．5mm。
成年外植体，关键在于通过少数细胞复壮，创造生理活性的新中心，具有物质的改向移动。新相关一旦建成，将可恢复全能性。施加选择压，在幼年期内，能强烈有效地缩短周期。
释放全能性最常用的简单方式，是用生长素和细胞分裂素和专化简单因素培养细胞。执拗种需注意其它问题。激发其形态建成，采用的生长素、细胞分裂素、赤霉酸用量要几倍于相应的自然激素内生水平。在固化培养基上，营养扩散和吸收常受限制，以改用液培较好。某些种培养过程中，不仅发生遗传变异，还可能包括营养物、生长调节剂，通气，低温和暗处理和协调效果的改变。选用最适于幼年或成年阶段的大、微量元素，也有控制作用。有些元素是酶的含有成分或其激活因子，从而限制这种酶活性。还各种类型的抑制剂，外植体形态建成可能包括自身产生抑制因素。这类物质能向周围扩散，会阻碍邻近细胞发生同向发育或分化。但大多数论证，提出胚胎发生组织趋于诱导而不是抑制同类分化。另一种方法是供给外植体以辅因子，如生长素、细胞分裂素及其接合物、赤霉素、维生素、代谢产物、氨基酸、种子提取物、和其它因子。增加CO2或其它气体可能有利于控制发育。关键在于控制其供给率。加量要慢，和了解连续饲喂系统中的营养状况。
(六)预处理和预测
难繁殖和成年种，可用供体预处理以改进外植体生理状态：(1)严格除芽，整枝或剥离；(2)在幼年砧木上复接；(3)利用树秆桩蘖或吸根出条。(4)选择经几次连续芽繁殖循环的茎尖；(5)切取外植体前在人工培养条件下驯化供体植株；(6)喷液、糊液或注射合成生长调节剂；(7)环状制皮、光处理、切根、施肥或生长阻滞剂以改变营养与生殖生长平衡；(8)热处理、冷冻、光周期和黑暗以除去限制因素，用H2O2，重金属，生长素保护剂以除去抑制因素；和(9)改变营养状态从简单自养培养改为异养培养基，附加基质、辅因子和还原氮，反之亦然。包括短时间的饥饿状态或酶的活性控制(蛋白酶、淀粉酶和核酸酶)。
切取外植体由于改变了水合态、破伤、表面消毒和氧化作用以及新环境和营养刺激影响使预处理解释复杂化。生长调节剂内生水平高时切取组织，可能改进培养中的外植体状态。立即引起钙分布、中子泵、离子吸收、核苷酸生物合成。当细胞生理状态超过某种阈值时，新状态可能导致转向形态建成。
复杂的非直线变数常关连到继后发育状态，着重于诸变数间相关。例如大田虎尾枞以精氨酸为主要储藏物质，其对总氮的影响与环境变数有强烈相关。这可与生物气候学和树的生化稳定性有关。了解外植体源的影响，必需充分揭出它们的功能，并以表格形式表达之。外植体选择是作物遗传工程和克隆繁殖的基础和因果一步(有限生长的和无限生长的)。木本多年生种具有幼年和成年，尤为重要。
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