细胞突变体的产生
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第234页（11876字）
(一)起始材料的选择
选择分离突变体的植物细胞材料可决定离体分离突变体的成败。在某些情况下，起始细胞材料决定于选择的性质和目的，如玉米胡麻斑霉T小种毒素的抗性，只在玉米T-cms细胞系上应用。另一方面，选定一个种也常常考虑到方便问题，如选定一个种可因其易于掌握合于需要的选择或因其易于进行细胞培养。在某些情况下，由于没有合适的亲本细胞系，未曾实现选择方案的全部潜力。
起始材料的某些状态是决定性的。如果亲本细胞系不能再生植株，那么变异细胞系很可能不能再生，因此，对植株的遗传分析和生化分析就不可能了。因此大都采用再生能力强的烟草细胞系，而不用不能再生或再生力弱的细胞系。此外，如可利用染色体数目稳定的细胞系，就应避免采用非整倍体的细胞系。因为后者使遗传和生化分析复杂化或甚至不可能。如果选择亲本细胞系只是为了方便，那么应选用染色体稳定的，能再生的细胞群。注意到这点，可从突变体再生苗，而本来未曾再生过，如从烟草的抗对氟苯基丙氨酸再生植株。如果想把细胞系用于选择体细胞杂种的话，染色体稳定性和再生能力特别重要。两者缺一，就不能产生杂种植株，或产生无法进行遗传分析或不能经有性生殖传代的体细胞杂种植株。
在选择亲本细胞株时，也必须考虑用单倍体、二倍体或高倍体的细胞系。如前面关于营养缺陷细胞系的讨论中所指出的那样，为鉴定隐性突变必须用单倍体细胞系。然而，细胞系的单倍染色体的稳定性决定其可用性。单倍体在体外培养是不稳定的。例如，虽然很易得到林烟草的单倍体，并保持单倍体的植株，但在细胞培养中很快就多倍体化。在这样的情况下，使用“单倍体”细胞系，事实上不比用二倍体细胞系好多少。只报道了一个稳定的南洋金花单倍体细胞系，已被成功地用于分离营养缺陷突变体。虽然烟草单倍体细胞系也曾用于分离营养缺陷体，必须指出，烟草是异源四倍体，因此，花药培养获得的不是真正单倍体。如预期的那样，Carlson(1970)分离到渗漏性营养缺陷体。
用单倍体细胞系分离显性突变体可能是不必要的，如大多数抗代谢产物的稳定突变体可能是二倍体细胞系，这一点已反复证明。因此细胞培养物的倍数性高于单倍体水平，在体外会更稳定，进行实验时用这种细胞系同样是方便的。为了进行遗传分析，再生二倍体植株比再生单倍体植株更有用。然而，从单倍体细胞系再生二倍体植株是不常见的。在对分离出的二倍体或高倍体的细胞系突变体进行遗传或生化分析时必须注意，从体外分离的变异体可能是杂合的，在R1代可能发生分离。
亲本细胞系的生长速度可能会影响在体外分离突变体的成功与否。一些抗代谢产物在培养基中只有很短的半衰期。如果有关的细胞系生长很慢，那么抗代谢产物可能在敏感细胞死亡前降解。因此，敏感的变异体可能会在不允许其生存的条件下生存下来。生长缓慢的细胞也更易发生染色体数和结构的变化。这些变化可使植株再生困难或甚至不可能，尤其当在培养体中累积了非整倍体时更是如此。即使并不需要再生植株，非整倍体也因基因的剂量效应而使生化分析的解释复杂化。如果直接在悬浮培养体中进行选择，而不用在固体培养基上植板的办法的话，问题会更加复杂。用3-4天继代一次的悬浮培养物和从其产生的原生质体是很理想的。这种培养物，如烟草的Su／Su培养物可在几年内保持再生能力和染色体稳定性。但这种培养体的用途也是有限的，因为它是白化细胞系，而且烟草又是异源四倍体。
(二)细胞来源
各种来源的细胞都用来在体外分离突变体。根据下述理由，生长在固体培养基上的愈伤组织不是一个有用的细胞来源：
(1)细胞生长得比悬浮培养的细胞慢。
(2)细胞不是均匀地与培养基中的选择因子相接触的，生长在琼脂表面的细胞接触到较高浓度的选择因子。
(3)细胞在一个大的团块中生长。因此如果对抗代谢产物有抗性的细胞被大量不能生长的敏感细胞所包围时，也不能生长。
(4)最后，在愈伤组织中均匀地应用物理和化学的诱变剂是不可能的。这些限制多数是因为细胞生长成一个大团块。
用于分离突变体的二个最常用的细胞来源是悬浮培养物和原生质体。原生质体更加易变。可从植株直接分离细胞(通常是叶肉细胞)，也可从悬浮培养物得到原生质体。在这二种情况下，都可利用单细胞群体。这使诱变处理和选择剂可均匀地使用。细胞团和再生的植株都是来自单个细胞，因此不可能是嵌合体，不幸的是原生质体分离和培养技术还不能应用于所有植物。在有些种类中，可以发生和保持悬浮培养物，但原生质体不能分裂，或增殖率及植板率极低。为了分离突变体而分离大量的原生质体是很费钱的。因此，原生质体并不总是一种理想的细胞源。
在分离突变体时，最广泛使用的是悬浮培养细胞。迅速生长的细胞悬浮物(至少3-4天转代一次)可象微生物一样操作。最经常碰到的问题是悬浮培养中细胞团的大小。大的细胞团也可发生愈伤组织同样的问题。然而，可用过滤的办法从悬浮培养物中除去较大的细胞团。细胞的大小会影响所用的过滤器的孔径，对于大多数植物细胞可用200-400μm的滤器。30个细胞左右的细胞团可以进行植板，并容易长成更大的细胞无性系。在适宜的条件下，可能分离到对代谢产物抗性增高的单个无性系。因为每个无性系可能起源于一团细胞，而不是单个细胞，因此分离单个细胞(如原生质体)可能更有利于得到一个纯系。
曾经已从悬浮细胞直接分离和从植板于含有选择剂的固体培养基上的细胞中分离到突变体。当在悬浮培养中直接选择时可能碰到许多问题。
(1)因为大多数细胞是对抗代谢产物敏感的，存活的细胞是培养在由死细胞使其富有营养并含有它们可能放出的毒素的培养基中。在含有琼脂的固体培养基，有毒产物的扩散和死细胞的影响可降低。
(2)在一个培养瓶(如三角瓶)中，不能选择单个的无性系，因为在悬浮培养中细胞团被不断地打散。而在固体培养中在同一个培养瓶(如培养皿)中，可以选择多个细胞无性系，因为培养在固体培养基上，限制了从细胞团中放出的细胞的分散，使其发育成各个无性系。
(3)如果交叉饲喂作用对于敏感细胞的生存是重要的话，那么由于在液体培养基中扩散作用较大，因而其交叉饲喂作用也比固体培养基中大。
(4)如果是选择对抗代谢产物的抗性，那么悬浮培养物生长缓慢增加了选到非整倍体细胞的可能性。如前所述，非整倍体可能影响再生能力，并使遗传分析复杂化。
(5)如果这些细胞回到悬浮培养时，那么从悬浮培养物中除去较大的细胞团就更困难了。较小的细胞团在固体培养基上植板时比转至液体培养时似乎更易成活。
(6)最后，必须考虑操作大量悬浮培养物及大量的培养皿的困难性。在固体培养基上植板，显然比悬浮培养中直接选择优越。
在愈伤组织、原生质体或悬浮培养物中所鉴定的突变，可能不能在再生的植株中表现。如在悬浮培养中抗5-甲基色氨酸的细胞系再生植株对其衍生物是敏感的。从这些植物发生的愈伤组织能抗5-甲基色氨酸。另一方面，胡萝卜胚和小植株能抗放线菌酮，而愈伤组织培养体则是敏感的。因此难以区分从野生型和突变体再生植株。在再生植株中没有所选择的表型是不能令人满意的，尤其是用于农业上的特性。
有些表型可能在愈伤组织培养物上没有表现，而只表现在植株。例如，愈伤组织，悬浮培养物和原生质体培养物都无光合作用活性，因而不能选择与光合作用有关的突变。例如，尽管胡萝卜愈伤组织抗除草剂Metribuzin，而胚和植株是敏感的。在这一事例中，设计了一种新型的选择程序。因为依赖于光合作用的胚培养体是对Metribuzin敏感的，因此，可在胚培养物中选择对除草剂的抗性。这样一种选择程序用任何光合作用抑制剂都能生存。事实上，Ternpleton-Somers已经证明非致死浓度的链霉素引起胡萝卜光合作用胚的白化，同时极少抑制生长。这可用作抗链霉素绿色胚的选择系统的基础。Maliga等(1973)用链霉素对转绿中的愈伤组织和再生苗的白化作用，以选择抗链霉素细胞系。
(三)诱变
在体外分离高等植物的突变体时使用诱变剂的必要性尚未得到满意的证实。人工培养中用与不用诱变剂分离到突变体效果相同(表11-7)。已经报道的15个营养缺陷突变体中有14个是诱变后才取得的(表11-7)。而唯有一个未诱变细胞是用BudR选择的，而BudR本身具有诱变剂的性质。在分离营养缺陷体时，物理的或化学的诱变剂对于高等植物细胞都是有效的。甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝基胍(NTG)和伽玛射线都用得很成功。另一方面，已经报道的从体外分离的16个对抗菌素有抗性的突变体中，有14个未经诱变处理。由于许多抗菌素抗性的特性是细胞质遗传的，常用的诱变剂对细胞器DNA和核DNA不一定是同样有效的。可能所用的诱变剂对细胞器DNA的作用大于核DNA，诱变可能会提高分离突变体的成功机会。
表11-7 体外分离突变体用诱变剂的情况
a．用BudR选择分离的，BudR本身有诱变作用。
如果使用诱变剂，必须决定是用物理的还是化学的。由于在高等植物中并不表现出那一个更优越，因此，便于操作成为决定性的因素。一些报道指出物理诱变剂有一些好处，如诱变后无须对细胞进行处理，以除去诱变剂。不幸物理诱变剂需专门设备，如伽玛射线。诱变时用紫外线是很方便的。可在无菌的条件下进行诱变，如用手提式的紫外灯在超净台上进行处理。然而，紫外光处理后须把细胞暗培，以减少DNA的光诱导修复。
如果用化学诱变剂，诱变后必须彻底清洗细胞以除去残留的诱变剂。这一过程可能象诱变剂一样会损害细胞，尤其当所用的细胞是极其脆弱，如原生质体。此外，由于用来洗涤细胞的介质含有有毒的物质，废物和玻璃器皿去污染处理都成了问题。
某些选择程序，如选择抗氨基酸衍生物的细胞系，已很明显，无论诱变过的还是未诱变过的细胞都同样有效。一个有效的诱变剂必定会引起DNA的广泛损害，进而引起有益基因的突变。因此，在选中的细胞系中可能还有别的附加变异。其次，非选择的突变可能降低生活力，干扰再生植株，影响花粉的可育性，或引起无数其他作用，这些作用会干扰突变体的植株再生和遗传分析。另一方面，自发突变可以设想为细胞系中的唯一突变，在选中的细胞系中非选择的突变可能以不能察觉的水平存在。因此，从未经诱变的细胞系中选择可能更有利。
在体外选择所需的性状前，诱变处理后应让细胞生长几代，使突变发生分离，并在细胞中表现出来。如果诱变剂只修饰一股DNA链时，在选择一种表型前至少使每股DNA链都带有突变，是很重要的。如果不是每股DNA链都有突变，那么这种突变可能不能转录和表达。如果在诱变后不让其生长一段时间，可能不能测到对选择剂的抗性。
(四)选择方法
在体外分离突变的最终成功还有赖于使用适当的选择程序。当然选择与分离的突变体的特征有关。例如，为研究色氨酸生物合成，Widholm(1972)分离了抗5-甲基色氨酸的细胞系。对除草剂(如毒草定)的抗性可直接在细胞培养体中选择。这些例证指出只要鉴别所需问题和适当的选择剂。高等植物体外选择的大多数突变体都是直接选择的。
已知许多化合物对培养的高等植物细胞有毒，例如表11-8。有时这些化合物会引起产生农业上有用的突变。例如抗取代的2，6-二硝基苯胺除草剂或Metribuzin可能有现实价值。抗重金属如锌、铜，或铝的突变体，可能增高在以前不能种植作物的条件下种植的可能性。虽然分离过耐盐的细胞系，Smith和McComb(1981)检查了耐盐和对盐敏感种的耐盐性。Tal(1983)更详细地讨论对不良环境条件的耐性。许多这类对植物细胞有毒的化合物，可当作在体外分离突变体的选择因子。
表11-8 用于体外分离突变体的潜在选择因子
对于那些难于或不能在细胞培养体直接选择的表型，用间接选择方法是有价值的。例如，已用两种方法在体外分离到抗病细胞系。Carlson(1973)选择了抗由烟草假单胞菌所引起的野火病的细胞系。Gengenbach和Green(1975)用更加直接的方法分离抗南方玉米枯萎病的玉米细胞系。选择抗玉米胡麻斑霉毒素的细胞系。Behnke(1980a)用相似方法分离出抗马铃薯晚疫霉毒素的马铃薯细胞株。由于在体外直接选择抗旱性有困难，有人提议选择超量合成脯氨酸的细胞系(曾经观察脯氨酸超量合成是对干旱的反应)。抗羟脯氨酸的衍生物的突变体可超量合成脯氨酸。在许多情况下，间接选择可以产生所需表型。
选择对抗代谢产物的抗性是在体外筛选突变体最简单方法。若干因素影响一个选择系统的成功与否。(1)抗代谢产物的作用应是不可逆的，即这种因子是致死的，不仅抑制生长。(2)选择因子不会被培养基本身的因素或野生型细胞所降解。否则，敏感细胞应在化合物降解前死亡。在选择因子不稳定时，在抗代谢产物降解后，细胞可恢复并开始生长。虽然分离到的细胞系中有一些可能是抗性的变异体，但有许多是敏感的。
选择营养缺陷突变体是困难的。多数程序都依赖使用杀死生长细胞的化合物，但不影响未生长的细胞。BudR选择方法，它已成功地用于高等植物，正是根据这一前提的。生长较缓慢的相互饲喂和渗漏突变体用这类选择不能有效地取得，因为有毒的化合物可以同时渗入突变细胞及野生型细胞。然而，如果没有这种选择方法，只能用非选择细胞的大量筛选方法选择营养缺陷型突变体。这是选择高等植物营养缺陷突变体最常用途径。
(五)分离突变体的常用程序
1．在植板或诱变前4天把细胞继代。细胞应尽可能用高密度，并保持指数生长。以烟草为例，至少每隔4天继代一次，此时它们仍然保持指数生长。
2．不管是用物理或化学诱变剂，诱变后，应让细胞生长几代。烟草细胞诱变后生长4天即适合于突变的表达。
3．把细胞进行过滤，以除去大细胞团。保留30个左右的细胞组成的细胞团，但小一点更好。烟草悬浮培养可用网孔大小为250-350μm的过滤器。
4．把过滤的细胞与等体积的含有1．2%琼脂的熔融的45℃愈伤组织培养基充分混匀(最后琼脂浓度为0．6%)。
5．把2．5毫升的悬浮在0．6%琼脂中的细胞，均匀地涂布在100毫米培养皿中的选择培养基的平板上。
6．在琼脂凝固后把培养皿用石蜡膜封边，暗培，直至可以看见1-2毫米大小的细胞群。对烟草细胞需要2-6星期。
7．把群体转至选择性的培养基上进行快速增殖。
这一程序设计可用于从烟草细胞悬浮培养物分离突变体。也适用于别的种，如从烟草和胡萝卜分离到突变体。把悬浮培养细胞在琼脂培养基上植板，是筛选对抗代谢产物有抗性的细胞的有效方法。细胞植板有若干种方法。(1)把一定体积的细胞直接滴在培养皿中的固体培养基的平板上。在这种条件下，如果培养皿移动的话，细胞团可能不能吸附在琼脂的表面或同表面离开。(2)可把细胞直接悬浮在固体培养基中，并倒成一薄层，如在100毫米的培养皿中倾入10毫升琼脂培养基。不幸，薄层干得太快。曾观察到埋在琼脂培养基中和生长在表面生长速度不同。此外，从琼脂表面取得细胞团也并非总能成功的。
此外，还采用了从微生物技术中引用过来的在预制的琼脂板上加软琼脂板的方法。这种方法把悬浮细胞直接涂布在固体培养基上，和在琼脂中植板的方法结合起来。因为细胞是在一层极薄的低浓度的琼脂中，可以达到接触空气良好，牢固地固定在琼脂表面，而且分布均匀。
制板程序描述如下：
(1)必须去掉大细胞团，以提高选择效果。把细胞用经酒精灯火焰消毒的不锈钢组织筛过滤。网孔大小与植物种类有关，但必须不能让多于30个细胞的细胞团通过。例如，烟草可用380μm大小的孔，胡萝卜网孔大小为230μm。滤过的细胞收集在一只无菌的烧杯中。
(2)过滤后，烟草细胞在植板前需经离心浓缩。并把其再悬浮在尽量少的溶液中。从许多三角瓶得到的细胞可以倒在一起用于制板。由于突变频率低，我们需在选择培养基表面倒一层细胞。与烟草细胞不同，用一个三角瓶所含的胡萝卜细胞数量就已足够。
(3)滤过的细胞用40-50℃含1．2%溶解琼脂的培养基以1∶1比例稀释(最后含0．6%琼脂)。把2．5毫升在0．6%琼脂中的细胞，倾在事先用25毫升固体培养(含1．0%琼脂)做成的平板上。在软的琼脂凝结后，用石蜡膜把培养皿封起来。由于制板的细胞只占平板最终体积的10%，因此选择因子的浓度应比所需要的高10%，这样制板后，抗代谢产物可达到所需的浓度。
当细胞在选择培养基上植板后，培养条件与筛选成败关系密切。例如衰老的烟草细胞光培下会产生酚类化合物，而在暗培则没有。因此，在以暗培选择更好。选择的性质也可能必须用暗培细胞。抗对-氟苯丙氨酸的烟草SU／SU变异体，在光培时产生大量酚类化合物，因而不能存活。对有些种类，如胡萝卜，酚类化合物不成问题。在暗中生长也可排除选择因子光降解的可能性。所有其他的培养条件，如温度、培养基成分等，都应最适于细胞生长。对细胞的唯一胁迫应是选择因子。
(六)变异细胞系的初步分析
从细胞植板到出现细胞群体可能需要很长时间，例如几个月。培养基干化可能仰制生长。因此尽快把细胞克隆从选择培养基上移植出去很重要。细胞应移植至不含选择因子的新鲜培养基上，使其迅速增殖。当细胞团长到可以分割时(这一阶段因植物种类而异)，应将其分别继代至选择培养基，植株再生培养基和保持在非选择培养基。因为长期体外培养(尤其是在胁迫条件下)会丧失再生能力，因此尽快再生植株很重要。
这样分离的变异体中只有一部分是稳定的突变体。例如，从烟草Su／Su，分离的250个抗对-氟苯丙氨酸(PEP)细胞系中，只有21个是稳定地抗苯丙氨酸衍生物的。变异体的稳定只有在没有选择因子的条件下长期继代培养后才能确定。用任何选择系统在体外分离的变异细胞都应证明其是突变体。有一些特征可用来确定突变体，即具有稳定地改变了的基因组成的细胞。(1)突变体发生的频率低，在没有诱变时频率是10-6-10-7。在经过诱变以后突变频率可以提高100倍。如果选择的变异的表型发生的频率高达10-2-10-6时，这种变异不太象突变，应设想为生理适应。(2)突变在没有选择剂时应是稳定的。生理适应性在有抗代谢产物存在时可能诱导一些生化功能。在没有选择压力时，变异体恢复到敏感性。如果变异细胞系是突变体，在没有选择因子的条件下长期培养后仍然保留所选择的表型，植株再生应具有下列特征：(3)一种突变细胞系必须在再生植株后保持稳定。虽然再生的植株可以表达，也可以不表达选择的表型，但从其启动的愈伤组织应表达选择的表型。(4)选择的表型的有性生殖传递保证其确是突变体。Chaleff和Parsons(1978)表明对于毒草定抗性的有性生殖传递，并观察到抗性的和敏感的表型的孟德尔分离。许多情况下从突变体再生的植株是非整倍体或不育的，遗传分析就复杂化了。
在愈伤组织或悬浮培养体都可以筛选对衍生物的敏感性。在悬浮培养体中测定对衍生物的敏感性更加快速，因为细胞是完全浸在抗代谢产物中的。然而，必须在有选择因子存在的情况下，多次继代培养，敏感细胞才会死亡。选择因子扩散入愈伤组织可能延长杀死敏感细胞的时间。应淘汰在没有选择的情况下失去抗性的细胞系。可用下列方法分析一个细胞系对抗代谢产物的抗性，即或者把细胞悬浮体在不同浓度的抗代谢产物上植板，或测定在有抗代谢物的悬浮培养体的生长曲线。
含有细胞团的悬浮培养体也曾用于植板，因此变异细胞系也可能是嵌合体。由于细胞系缺乏均匀性，也可能使以后对再生植株的遗传分析和生化分析复杂化。从变异细胞系分离原生质体并进行培养，可用于分离嵌合体并产生同质的细胞系。此外，如果要把变异体用作体细胞杂交的亲本，从变异细胞系分离的原生质体，在有选择因子存在时的行为也是至为重要的。
在体外分离的突变体分析有两条途径：即突变体的生化结果和遗传行为。对突变体是否进行生化分析或遗传分析，取决于突变研究目的。然而在细胞培养中进行一些遗传分析也有可能，如，Glimelius等(1978)用原生质体融合表明，由Muller和Grafe(1978)从烟草分离的硝酸还原酶突变体是隐性，并确定了二个等位基因，cnx和nia。在容易进行营养繁殖的植物(如马铃薯)，尽管对突变体的遗传分析有意义，但并不一定有用。
几乎在所有情况下对突变体进行生化分析都是可能的。任何突变体都可对细胞培养物或再生植株进行分析，这可能会对植物的组织化和发育的理解作出贡献。然而，如果只把突变体用作遗传标志，就不必作生化分析。
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