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出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第262页（9239字）
在建立组织培养系统来研究植物抗病性问题时，有很多因素需要考虑，最基本的是，系统选择必须是有所研究的抗性。比如病原菌生理小种专化抗性的生化基础研究，就需要有一个寄主和病原菌的遗传学特性很好确定的系统，而且有可采用的寄主和病原菌小种的近等基因系。另一方面，非寄主抗性研究，则可用较少限定的系统。在这二个情况下，关键是所确定的条件(如，培养基成分、温度、光、接种量)能使抗性在培养条件下表达。另一些场合，比如，在研究植物抗毒素的诱导和生物合成时，只要植物抗毒素能够产生，抗性的表达并不是一个主要因子。在这些场合下，必须考虑到影响植物抗毒素积累的因素(如，培养基成分、培养细胞的年龄、诱导剂的种类和浓度)。
(一)组织或细胞培养的类型
在利用组织培养来研究抗病性问题时，第一步就是考虑选用培养系统的类型，即：愈伤组织培养，悬浮培养，游离细胞或原生质体培养，而每种方法往往对某一特殊方面的研究有利。至于愈伤组织培养物体和悬浮培养物的起始和维持，细胞的游离，原生质体的分离和培养。愈伤组织培养系统已被广泛用于生理小种专化的表达，和非寄主抗性的研究。这种培养比悬浮培养体、游离生细胞或原生质培养具有一些优点。包括(a)培养组织容易起动和维持；(b)可直接在愈伤组织上接上接种物(如孢子、游动孢子等)；(c)能用细胞学的手段跟踪病原菌的侵染和由此引起的愈伤组织克隆化在理化及寄主的反应过程。在以病原体刺激的愈伤组织中可以测定植物抗毒素的积累及与此有关的克隆化程度。另外，愈伤组织表达的抗性在悬浮培养体中可能不表达。
悬浮培养体通常被用于研究植物抗毒素的诱导和生物合成。植物抗毒素诱导药物(诱导剂)和标记的前体化合物，可以比较容易一致地加入悬浮培养系统中，有利于取样。另外，因为在悬浮培养体中，有少数细胞类型，所以简化了结果的解释(例如加入诱导剂后酶活性变化)。但是，必须考虑到这样的可能，培养的细胞在遇到外加化合物时会发生变化，改变其反应。游离的植物细胞可以更好地代表整体植株中的细胞。悬浮培养体，游离细胞和原生质体在很多方面为研究寄主与病原菌的专一性反应提供了极好的模式系统，特别是在研究植物细胞的过敏反应和(或)植物抗毒素积累的诱导剂和抑制剂方面。在研究植物抗毒素对植物细胞的毒害效应时，这些系统也是有用的。
(二)培养基成分
在研究组织培养中抗性的表达和植物抗毒素积累时，已经采用了多种不同的培养基。选择培养基的最好途径是挑选一种能使愈伤组织(或悬浮细胞)很好生长的培养基，然后作些必要的修饰。比如，要变动生长培养基中的植物生长调节剂的水平，因为无论是抗病能力的表达，还是植物抗毒素的产生，都是受培养基中生长素和细胞分裂素的影响。在烟草愈伤组织培养中，为了使Ppm抗性表达，必须要在培养基中细胞分裂素与生长素有一个特别的平衡。如果与吲哚乙酸浓度相对的增高细胞分裂素或苄基腺嘌呤浓度，可以消除对Ppn的抗性。但△2-异戊磷基腺苷(2ip)却无此工作。由此可知，可能有必要测验几种植物生长调节剂的几种浓度，以确定最适培养基，以供寄主组织生长好和表达抗病性。
还发现抗病性表达也受愈伤组织的形态影响，后者也是受培养基中的植物激素的浓度影响的。烟草和马铃薯的紧密愈伤组织，分别对Ppn的不亲和小种P．infestans产生抗性，但疏松的愈伤组织就不表现出抗性。相当疏松的苜蓿愈伤组织能对Pmm和Pmg表现出抗性；但是，在这一系统中愈伤组织的形态还是重要的，那些表面湿润光滑的愈伤组织比表面干燥的愈伤组织更迅速更广泛地克隆化。苜蓿的愈伤组织的干燥程度随着培养基中激动素浓度的升高而增加。
(三)病原菌
很重要的是要分离得到遗传上一致的病原菌进行研究，特别为了研究抗性小种专一性。这可以分离从单孢子或单个细菌孢子生长得到的细胞达到目的。
大多数兼性植物病原菌可以在未确定的培养基上生长，如V-8培养基，通过不断接转移到新鲜培养基上加以保持。但是，长时间维持在人工培养基上，可能导致病原菌侵染性的降低和致病能力的消失。分离得到的病原菌，应当通过接种于寄主植物观察其症状的发展，以定期检查其侵染性和致病能力。在培养中，假如侵染性降低的话，可经过在植物体上接种几个循环与再分离，就可使其达到能利用的水平。
(四)接种物
细菌细胞，纯化的病毒制剂，真菌孢子，游动孢子，孢囊和菌丝，已被成功地用来感染愈伤组织。接种物的条件是很重要的。虽然菌丝接种更容易，但经常多用真菌孢子、游动孢子或孢囊而不用菌丝。一些研究结果表明，愈伤组织抗性的表达，对接量的变化是相当不敏感。比如，马铃薯愈伤组织块在接种量为100和1000个孢囊／组织块时，表现出对P．infestans的抗性，但在5000个孢囊／组织块时，开始遭受破坏，接种量的大小变化会影响愈伤组织中植物抗毒素的积累；洋刀豆的愈伤组织中，Medicarpin的积累，随着Pithomyces chartarum(Berk和Curt)M．B．Ellis(一种洋刀豆的非病原菌)孢子浓度的增加(10-4-10-7孢子／ml)而增加。
(五)温度
在一定的温度范围内，愈伤组织的抗性反应和敏感反应的区别是很容易辨别的。烟草愈伤组织在20℃、22℃和24℃时，可对Ppn表现出抗性，但在28℃时不表现，而抗性反应和敏感反应的差异在20℃时表现最佳。大豆愈伤组织对不亲和小种Pmg抗性反应在16℃和20℃，但24℃或28℃不表达。在马铃薯／P．infestans系统，组织反应的最大区别发生在20℃，而且12-16℃时，敏感愈伤组织也表现出抗性，在24℃时，抗性愈伤组织克隆化。因此，应当在一定范围内的温度里，试验寄主与病原菌的互作，以确定能使抗性与敏感寄主组织间表现出最大差异的温度范围。
关于在愈伤组织中植物抗毒素的积累的报道甚少，但最近报道指出，植物抗毒素在愈伤组织的积累，是受温度影响的。马铃薯愈伤组织对P．infestans的无细胞菌丝匀浆的反应，研究表明，Rishitin和Phytuberin的生产以20℃比28℃为高，马铃薯块茎切片也观察到了这种现象。
(六)光
光照对愈伤组织抗病能力表达的影响，还没有被完全证实。在烟草／Ppn系统中，利用一些光照方法进行实验，发现它不是个重要因子，对研究异黄酮类抗毒素的诱导来说，应用暗培，因为许多黄酮类和异黄酮类的合成酶是光诱导的。
(七)苜蓿愈伤组织培养体中抗病性与植物抗毒素积累的估价方法
1．组织培养生长培养基 组织培养体生长于修改的SH培养基上，在每批培养基中，都只采用新制备的生长调节剂溶液。在无机元素、维生素和生长调节剂的母液按适当量混合以后，称一定数量的肌醇和蔗糖溶于培养基中，最后以蒸馏水定容到一定体积，以1N NaOH调节pH至5．9，加入琼脂，并在100℃下蒸煮一定时间，使其溶解时间长短由培养基的体积决定。然后，在150ml的医用培养瓶子中分装40ml培养基，并封好，再在121℃，20磅／吋2下消毒20min。瓶子水平放置，这样培养基铺成约1．5cm厚，然后，在超净台上冷却，以防污染。或将培养基(40ml)分装在100×20mm的塑料培养皿中，待培养基冷却后，用于启动组织培养，培养皿应以石蜡膜封好，以防干燥和污染。
2．组织培养体启动和维持 苜蓿的组织培养体是从两个品系的未成熟子房启动的，一个是抗Pmm的(M194)，一个是敏感的(M269)。取2-4mm长的花芽，在95%的乙醇中浸3min，进行表面消毒，然后在1．1%的次氯酸钠中浸3min(商品漂白剂以1∶5稀释)，再以用无菌蒸馏水淋洗两遍。无菌操作下从花芽中分离出1-2mm长的子房，移到SH培养基上。培养体培养在21±1℃下，暗培4-6个星期，然后把愈伤组织块切成直径3-5mm小块，转移到新鲜培养基上。愈伤组织块生长在同样培养基上4-6周，直到直径2cm左右，用这种愈伤组织块来研究真菌的克隆化和植物抗毒素的积累。
3．真菌培养物的分离和培养 本系统中用的Pmg分离株(小种1，分离系16)，来自Grau大学。苜蓿病原菌的纯培养物(Pmm)，是从Pmm侵染的土壤中经过诱导分离获得的。这一培养物经诱导形成游动孢子，将这种孢子铺在2%水琼脂培养基上。选择单个发芽的孢囊，移至V-8琼脂培养基上。这些研究中所用的分离菌种(分离菌种5b4)就是从这种群体中得到的。Pmm和Pmg都培养在V-8琼脂培养基上，温度22±2℃并有光照。分别以苜蓿和大豆定期地测验Pmm和Pmg的致病性。
4．接种程序 以Pmm或Pmg的菌丝接种到培养4-6星期的M269或M194愈伤组织块上。从生长在V-8培养基上，培养4-6天克隆边缘取1mm2的大小的接种小块。去掉多余的琼脂，用长柄的接种针把接种小块放于愈伤组织块顶部，接种的愈伤组织暗培在21±1℃下，培养12h、24h、48h或72h后，从瓶中取出愈伤组织块，检查菌丝的发育和植物抗毒素的积累情况。以未接种的愈伤组织块作对照。
5．对整块愈伤组织的估价 每天对愈伤组织块进行估价，观察菌丝的克隆化和组织变色情况。用下列估值系统来表示菌丝的克隆化：
0=无可见气生菌丝
1=气生菌丝占愈伤组织顶部的25%
2=气生菌丝占愈伤组织顶部的50%
3=气生菌丝占愈伤组织顶部的75%
4=气生菌丝占愈伤组织顶部的整个表面
用相似估价系统测定组织变色程度。
表12-1列出对典型实验的克隆化和变色估价。
6．愈伤组织的菌丝发育的测定 把愈伤组织块(每种处理三个重复)切成1cm2大小，然后分成二半，一半用来测定克隆化程度，另一半克隆化的组织用来测定含Medicarprin的量。为了测定变色水平，把分半的愈伤组织小片，横向分成相等四小片，每小片固定在载玻片上，用乳酸酚棉蓝，10ml甘油，10ml乳酸，0．02g苯胺蓝和10ml蒸馏水染色。玻片放在解剖镜(20倍)下检查，克隆化主观地按照0-5的等级划分，如果组织切片中没有菌丝出现，则为零，而如果切片中菌丝形成一厚层皮则其值定为5。以Pmm或Pmg接种以及不接种的对照实验，在72h后，M269和M194组织切片中的克隆化水平示之如图12-1。
(八)植物抗毒素的定量分析
1．抽提 在抽提和分析植物抗毒素中所用的有机溶剂(乙醇、氯仿、甲醇)都要经过氯化铝过滤纯化，然后再次蒸馏。水要通过逆向渗透，随后再经过Milli水纯化系统的过滤进行纯化。
在测定每个愈伤组织块的一半中克隆化程度后，把剩下的一半克隆化的组织(100-500mg)放入预先称重的试管中，测定鲜重。然后加入5ml95%的酒精，在22±2℃下，放置48h，然后放入冰箱，直到进行抽取过程时取出。
样本加温至室温，然后把组织和乙醇都移入一个90ml的Sorrall Omnl Mixer杯中，再以10ml，乙醇洗涤样本试管(每次2ml洗5次)，然后也加入杯中，将组织高速磨碎15s，磨3次，再次间隔5s。样品以装有Whatman#50滤纸的Hirsch漏斗，真空过滤，直接滤进100ml的蒸发三角瓶中；杯子以酒精洗5次，每次2ml，加入滤液中。滤液中加水5ml，在40℃真空条件下，转化为水相溶液。在配有Teflon活塞的250ml分液漏斗中，以三体积的氯仿从水中进行提取，反复3次(共9体积)。氯仿相溶液在40℃下置于真空中干燥，残留物重新溶于5份0．2ml的氯仿，然后转入与已用10ml氯仿漂洗过的硅Sep-pak药筒相连的1ml玻璃注射器中。在Sep-pak药筒中加入样本，然后用10ml氯仿慢慢洗提出来(3ml／min)。开始2ml丢弃，收集剩下的8ml，放在40℃真空下干燥，残留物溶于1ml甲醇，用作高压液相色层分析(HPLC)，图12-2表示Medicarpin，Sativan和层析Vestitol的抽提曲线。抽提最初10ml氯仿中是Medica．rpin和Sativan。而Vestitol还留在药筒上。通过收集部分3到10，可将Medicarpin和Sativan从众多的干扰物质中分离出来。通过向未接种愈伤组织中加入已知数量的植物抗毒素。再用上述方法分离，可计算的Mediearpin的回收率约为85%。从Sep-pak药筒收集部分2-10可得到Medicarpin和Setivan的回收率更高。
图12-2 用氯仿作诱剂从二氧化硅Sep-pak药筒洗提抗毒素Medicarpin，Sativan和Vestitol
愈伤组织中存在的无论何种Vestitol，用这一过程(氯仿粗抽提液干燥，重新溶于甲醇，再以HPLC层析)都不能检测到。因此，在所有Pmm或Pmg接种72h后的愈伤组织，以及所有未接种的对照愈伤组织中，没有测到有任何Vestitol的存在(剩余体积=8．0ml)。
2．HPLC分析 利用配有一个Bordapak-C18分析柱的HPLC仪器，以440型紫外光检测器，同时在280和365nm处测吸光率，这一系统的洗脱液以甲醇／l%稀醋酸(65／35；v／v)作为溶剂，流速1．5ml／s，平行流动。利用这一系统成功地溶解了Medicarpin和Sativan。Medicarpin的峰值出现在注射后5．5min(剩余体积=14．7ml)。根据柱的条件不同以及或系统中连接管道的长短，剩余体积略有不同。用标定曲线可分别从Medicarpin和Sativan的峰值下的区域计算出它们的浓度。
利用这些过程，已经在愈伤组织中分别测到了浓度低达1μg／g组织鲜重和0．4μg／g组织鲜重的Medicarpin和Sativan。在最高灵敏度时，可测出毫微克水平(10-20ng／注入样本)的Medicarpin和Sativan。
(九)抗真菌化合物的生物检测
利用薄层层析(TLC)-Cladosporium生物测验除Medicarpin和Sativan外，还可以在克隆化组织中检测到具有抗真菌活性的其他化合物，克隆化愈伤组织抽提方法与上述HPLC分析法一样，不同的是在以氯仿分配后，使氯仿溶液干燥，残留物溶于30-50μl的乙醇中。或者组织的乙醇抽提液浓缩到较小体积(30-50ml)，并直接检测。乙醇抽提液点样在TLC平板上(硅胶60，并在己烷／醋酸乙酯／甲醇(60／40／1，v／v／v)中显色。平板干燥过夜，然后喷上一薄层马铃薯、葡萄糖琼脂(POA)。应当特别小心地保持PDA薄层；喷时要很平缓，直到表面看上去有反光而且有木纹状。然后在平板上铺一薄层Cladosporium cucumerinum Ellis & Arth孢子。孢子，孢子悬浮液是从黑暗20℃下PDA斜面上生长了4-6天的真菌培养体制备的。在5个培养物上，各个地约浇上10ml蔗糖／盐培养基(表12-3)。以玻棒或金属环在表面刮去孢子。得到的悬浮液经过三层干酪包布过滤，然后喷在覆盖有琼脂的TLC平板上。在塑料匣里衬上湿纸巾，水平地放入平板，盖上盖子，培养3天。有抑制作用的区域在橄榄绿的背景上显出白色。
表12-3 用于TLc-Cladosporium生物检测的C．cucumerinum悬浮孢子的培养基
各种类型的植物组织和细胞培养体，都各自为植物抗病性的某一特殊方面研究提供了极好的典型系统，在研究植物抗毒素生物合成的诱导和调节时，悬浮培养体特别适用；进一步研究将对这一过程有更清楚的认识，并有助于描写出植物抗毒素生物合成途径中的各个酶和中间产物，以及对病原菌产生的能诱导植物抗毒素积累的化合物进行分离及定性分析，这些系统也是很有用的。但是，正象前面注意到的，必须很谨慎地防止培养的细胞发生变化，这样可能对这些化合物的反应发生改变。
愈伤组织培养系统的研究已经证明，对植物病原菌抗性可以在人工培养条件下表达，并且，至少有一个系统(烟草／Ppn)，相同抗病基因能在整体植株中表达，在愈伤组织也能表达。这些发现表明，用愈伤组织培养系统对抗病性表达的关键重要性因子进行研究是很合适的。其中之一是感染组织内植物抗毒素的积累水平；但在所检查过的组织培养系统中，寄主抗性的表达，与植物抗毒素并没有根本的联系。因此，这些系统应当用来研究那些可能还不知道的抗病性机制。
原生质体近来用于两个关于寄主与病原菌专一性领域研究：特定小种毒素与植物细胞的互作，和多种病原菌产物对诱导过敏反应的作用。用一种由Helminshos porium rnaydis Nisik & Miyake小种T．产生的寄主专一性有毒物——HmT毒素处理玉米原生质体，然后对它作亚显微结构和生物化学研究，得到的有力证据表明，线粒体是HmT毒素作用的最初位点，用这种系统以及其他一些系统进一步研究寄主专一性毒素，应能为这些毒素的作用模式的建立及植物细胞对它们产生抗性机制提供有价值的认识，在后一个问题上，Doke和Tomiyama(1980)利用马铃薯原生质体研究了马铃薯与P．infestans中特定小种的机制。菌丝壁组成非专一性地诱导产生马铃薯原生质体的过敏反应。这种反应与以P．infestans不亲和小种感染块茎时观察到的反应相似。从P．infestans的亲和性菌丝中分离得到的水溶性葡聚糖能抑制过敏性反应，而不亲和菌丝则不能。这种葡聚糖的抑制效应，可能是因为它们占有原生质膜上的诱导物结合位点，或者是通过葡聚糖与膜的反应使得受体位点的结构发生变化。利用原生质体将会给这种系统中寄主与病原菌专一性的进一步研究带来方便，例如，证实膜与诱导物的结合，以及质膜上假定存在的受体特性。
愈伤组织培养体中，小种专一性抗性的表达，为利用简化、控制的实验系统，研究植物与病原菌间互作的关键因子，提供很好的机会。在许多事物中，这些互作，可能是高度复杂的，而人工培养系统可能提供了一个方法，来分开和识别寄主-病原菌互作的成分，这些成分最终导致了亲和性及不亲和性。
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