水稻
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第363页（11886字）
在史前时期，水稻就供养着人类，是世界40%人们的热量来源。水稻对早期文化的生存有重要作用。
(一)组织培育在水稻育种上的应用
1．二倍体培养 禾谷类作物组织培养最早再生试验成功的是水稻愈伤组织分化产生茎叶(芽)和根和再生完整植株。直到15年前，诱导禾谷类愈伤组织和持久生长很难成功。采用比用于双子叶植物组织较高用量生长素，解决了诱导愈伤组织生长问题。有足够高生长素的培养，能诱导禾谷类产生愈伤组织。
1960年代日本开始水稻组织培养研究，首次从茎节间成功地诱导愈伤组织成功。强调了酵母浸出液是其长期增殖的重要因子。Yamada等(1967)报道了诱导和保持愈伤组织生长的完全合成培养基。
Kawata和Ishihara(1968)用2，4-D加各种用量IAA从水稻根尖诱导愈伤组织，一年后，将其转移到分化培养基上(0．15M蔗糖，1%水解酪蛋白，5．7μM IAA，不加2，4-D)。分化产生一株再生植株。Sekiya等(1967)用IAA和吲哚戊酸(IVA)使愈伤组织细胞迅速增殖。Hendre等(1975)用2，4-D，IBA和NAA能以诱导水稻愈伤组织。在麦芽糖、葡萄糖或蔗糖为碳源，可保持其增殖。附加氨基酸无效。
Nishi等(1965)用稻根培养在LS(1965)加9．0μM 2，4-D培养基上产生了愈伤组织。把它转移到不加生长素的相同培养基上，光培，分化成芽和根，最后形成再生植株。是二倍体，有矮生、扭曲，短旗叶和白化苗等基因型。
胚产生的愈伤组织芽器官建成的组织学研究，指出在其表面上的微凹处产生叶原基。继而在反常尖端形成正常叶原基。转移到芽诱导培养基后，3天内由其径向分裂测得器官建成。9天内可见原形成层和原维管束组织，此时其最外层细胞变为分层的和分生组织状。这些叶原基也发育成毛茸和叶绿体。
Nishi和Mitsuoka(1969)从水稻植株的不同部位诱导的愈伤组织再生了不同倍数性水平植株。培养基是LS，加9．0μM 2，4-D，不加细胞分裂素。从胚和节外植体的愈伤组织产生了二倍体。花药培养可诱导产生单倍体、三倍体、五倍体以及二倍体和非整倍体植株。子房愈伤组织再生了二和四倍体。无论愈伤组织来自什么组织，相同倍数性植株的形态与其倍数性水平相一致。
Nishi等(1973)从愈伤组织诱导培养基LS加2．5μM2，4-D不加其它生长素和细胞分裂素长成植株。愈伤组织是用发芽10天种子的根，并在不加生长素培养基继代2个月后，诱导产生的。再经2个月后，每个试管都分化出芽和根。在第二和第三次继代中，形成再生植株百分率各降低到95和64。
培养不同体细胞组织的愈伤组织也能再生植株。Mascarenhas等(1975)将幼苗中胚轴切段的增殖中愈伤组织转移到0．54μM NAA，取得再生植株。Henke等(1978)；Wu和Li(1971)从盾片组织和子叶节培养中再生二倍体。Bhattacharya和Sen(1980)培养叶鞘细胞再生植株。Bajaj等(1980)从未成熟和成熟胚乳组织再生三倍体。它表现宽叶较高生长率和分蘖增多，与二倍体亲本相比。
综合前人水稻组织培养形态建成试验，Nishi等(1972)提出器官诱导发生的程度，仅依赖于采用生长素水平，分化依赖于唯一外源因子——生长素。在较低用量生长素中，经常观察到较高百分的器官分化。且与诱导培养基中所用生长素无关。当从培养基中除去诱导愈伤组织的生长素时，每种培养组织都发生分化。
值得注意，Cornejo-Martin等(1976)报道单用乙烯(0．36μM)将能促进水稻组织培养体的芽再生。器官建成最适比率需要0．18μM乙烯和2%CO2。一般言之，乙烯／CO2比率为2．5×10-4∶1，能诱导芽的再生。单用CO2对器官建成无效。
2．单倍体培养 Niizeki和Oono(1968)首次培养水稻花药成功，产生了单倍体植株。抽穗前约1-2天，将含有成熟花粉粒的花药，接种在加有9．4μM NAA，10．0μM KIN，和4．9μM2，4-D附加3ppm酵母浸出液(YE)培养基上。培养后花药壁褐色化，经4-8周，出现淡黄色愈伤组织。将其转移到不加2，4-D的培养基后，再生了单倍体。
花药外植体诱导的愈伤组织，证明是单倍体水稻栽培体的主要来源。诱导率为0．21-2．2%(Myint和deFossard，1974)。诱导产生愈伤组织后，在无生长素、细胞分裂素和有机附加物培养基上，再生单倍体。
Woo和Hsu(1974)试验了以Indica(籼)×Japonica(粳)杂种再生单倍体，作为阻止后代分离的方法。从F1花药仅再生一株有生活力的单倍体。用0．05%秋水仙素处理这个植株，使其染色体加倍，然后自交。F2与F1相同，提出秋水仙素加倍的亲本，是完全同质的。可是，后代仍有不育性。
Zhou和Yang(1981)在单核花粉后期，从小花取带花托的子房，培养在附加0．6μM2-甲基-4-氯苯氧乙酸培养基。愈伤组织诱导频率4．4%，在生长素用量降低到0．16μM后，产生再生植株。雌配子体产生的植株，出现各种倍数性水平的植株。
陈英(1980)用游离小孢子液体培养，取得再生成功。
Yin等(1976)描述了中国水稻单倍体育种程序，育成和推广了几个品种，包括Tanfeng1。将单核期花药培养在加9．0μM 2，4-D培养基上。愈伤组织频率为37．7%，平均16．3%。不加2，4-D时，产生再生植株。除白化苗频率高(再生植株的50%)外，经染色体加倍后，选出了几个有希望单倍体品种。田间试验结果，几个单倍体品种的产量达到8．34t／ha。还培育成品种Huayu1(花育)和Huayu2(花育)。胡含等(1978)报道了中国单倍体研究综评。
Deka和Sen(1976)首次报道从水稻叶鞘和茎愈伤组织分离原生质体成功。用2%果胶酶和3%纤维素酶，缓冲液pH5．4，加0．45M甘露糖醇作为渗透剂处理愈伤组织。当把它转移到含有2．3μM2，4-D，2．9μM IAA和0．47μM KIN的SH培养基中后，24小时内形成细胞壁。可是，除愈伤组织增殖外，未能再生植株。
从生长在18．0μM 2，4-D和2%CW的花粉愈伤组织也分离出水稻原生质体。用培养基0．23μM 2，4-D和1．3μM BA产生了细胞壁再生和分裂。从培养的原生质体未能再生植株。
3．农业应用 IRRI认识到组织培养的发展，1979年成立了植物组织培养实验室。从花药和花粉外植体的愈伤组织和再生植株中，筛选出籼稻品种的85个品系。单倍体愈伤组织的生长和再生效率比二倍体组织的较好。再生频率品系间有不同，某些品系高达53%，典型频率为3-10%。
采用单倍体，再生后立即可看出F2变异。通过基因型加倍，每株成为纯系。IRRI科学家估计，在热带可于15-21个月内培育成纯系，温带3年内可达到。常规育种至少7年。
IRRI组织培养育种规划的首要目标是筛选抗盐品种。从种子诱导愈伤组织，放在高盐培养基上。1981年3月，从抗盐愈伤组织再生了2000株。7月将再生幼苗转移到含盐水培中。生存植株结了种子，其后代正在进行大田试验中。
孙立华等(1984)用水稻种子愈伤组织与白叶枯病病原菌菌丝体共培养，在N6培养基上，诱导再生具有抗白叶枯病植株。
(二)培养方法
1．植株材料 水稻植株的任何部分(花药、花粉、子房、胚乳、胚等性器官和根尖、分蘖、穗、叶等体细胞组织)虽都能启动愈伤组织培养，可是，种子最为相宜，易于处置。为了从特定组织，如节、茎叶或根尖诱导愈伤组织，首先必需把无菌种子生长在装有无菌琼脂盐类培养基的三角瓶内。从这种植株上，在无菌条件下，取得节或根切段，接种在适宜琼脂培养基上，以诱导愈伤组织。
在无菌条件下，制备种子，其法与愈伤组织和种子发育的相同：
(1)选取充分成熟种子，去壳。
(2)用95%乙醇淋洗糙米，除去籽实表面蜡质。如果淋洗时间在10s以上，种子将会死亡。
(3)轻轻倒去乙醇，用双层纱布覆盖于烧杯上。用橡皮筋固着。
(4)用流水淋洗烧杯2-10h，洗籽实。
(5)将籽实浸入70%酒精的无菌培养皿中，5min。
(6)除去酒精，加3%次氯酸钠溶液，也可用强度减半的商品漂白粉代替。把覆盖的培养皿放置50min，偶或摇动含氯溶液。漂白粉溶液处理时间不能超过1小时。
(7)用无菌蒸馏水淋洗籽实3次。
(8)将种子接种在琼脂培养基上，以取得植株，或放在含有生长素的组织培养基上，以取得愈伤组织。
2．培养基 单倍体和二倍体培养的生长素最适浓度，比培养双子叶植物高得很多。2，4-D应为约22．6μM，NAA为537μM和IAA为570μM。这些对愈伤组织诱导和增殖是最适浓度。Chu(1976)和其他学者报道了N6培养基，对花药和花粉培养，比MS培养基为好。N6培养基成分见表17-1。
表17-1 禾谷类花药培养的N6培养基
(Chu等，1978)
a．5mI溶液含有0．02M FeSO4．7H2O和0．022M Na2·EDTA溶于1L蒸镏水中。
3．培养条件 诱导水稻愈伤组织最适温度为25-30℃之间。暗培胜于光培。愈伤组织可能形成松脆或紧密团块。细胞的松脆程度，影响着制备液体悬浮培养的难易。为了产生细胞悬浮体，将软、松脆愈伤组织转移到液体培养基中，每毫升加105-6个细胞。通常振荡速度是120rpm。
4．植株再生 降低2，4-D浓度或用弱生长素如IAA或NAA代替，能以诱导植株再生或芽器官建成。为了取得器官建成，外给细胞分裂素并不重要，但它可能加速器官建成。
再生的可观察的最初标志是在光照下培养的愈伤组织上出现的绿斑。继而发育成芽。当一个芽占优势时，其余的芽将不会旺盛生长。培养基的植物荷尔蒙与器官建成的关系，禾谷类愈伤组织与双子叶植物的不同。禾谷类愈伤组织的再生芽数比双子叶愈伤组织的要低得很多。应注意到每块愈伤组织分化一个芽，并不代表外植体顶端的延伸，后者为以前采用高浓度生长素所抑制。
(三)展望
1．产生变异 水稻花药培养、组织培养的植株再生重现体的建立，给遗传学家在育种策略以巨大灵活性，缩短了产生纯系的时间。能以从胚愈伤组织或花药愈伤组织常规地再生植株。
组织培养在植物育种规划中最有用状态之一，是它的产生变异的能力。从愈伤组织和悬浮培养体再生植株中，测得了点突变和染色体重组指出组织培养再生了具有许多变异的植株。
育种程序中，在评价前，要保持植株大群体。采用组织培养技术，遗传选择可在实验室内进行，容许在频率为10-5-10-6的罕见突变的选择。隐性和共显性基因能在单倍体培养系统中表达。由此，常规采用单倍体细胞培养技术，使之有可能在迄今不可能的规模上，进行个别变异体的筛选。
一旦建成单倍体细胞培养，可能选择抗盐、抗除莠剂、pH不平衡等的抗性个体。植物组织培养家已经建立了选择特定生化突变体的巨大专业基础。例如，Heyser和Nabors(1982)通过长期胚胎发生的培养体，取得了水稻耐盐、耐旱细胞系，但未能再生植株。
Schaeffer和Sharpe(1981)用S-氨乙基-L-异亮氨酸(S-ACE)(异亮氨酸的衍生物)处理花药培养体，能以提高水稻蛋白质含量。变异体在不加这种衍生物的培养基上继代30次后，还保持了S-ACE抗性。自交后，F2世代中若干个体游离赖氨酸含量增高10%，蛋白质含量增高48%。采用Chaleff和Carlson(1974)的同样试验方案，从它们的突变体系中诱导再生植株失败。
水稻组织培养曾用以从愈伤组织(由不同性组织产生的)再生各种倍数性植株(Nishi和Mitsuka，1969)。这方面值得深入研究，由于多倍体性曾用于改进植株生长旺势。
2．体细胞诱变 通过组织培养能以迅速克隆繁殖，使之成为突变研究的理想方法。这种技术通过变异体部分的克隆繁殖得以保存诱变的特性。常规突变育种，用离子辐射和化学诱变剂随机引起种子里的点突变。除非这些合子需要突变将性发生在性细胞里，体细胞突变将不能经有性杂交而传递。
单是诱变剂不足用以选择罕有特性。组织培养为突变育种家提供着巨大机会，由于突变细胞群体可在实验室里给以评价，而不是在大田里。
3．胚培养和原生质体培养 组织培养除能产生点突变外，还会使植物基因组产生主要改变的潜力。稻属20个种中，只有2个曾用于栽培。许多野生种具有有价值基因，如控制抗病、耐盐和金属毒性等。例如，Oryza nivira独有glassy stunt病毒抗性。以后把这种抗性位点转移给几种IRRI品种。可是，用常规方法不可能进行无血缘关系基因组间的杂交，组织培养为此提供着两种潜在解决办法。
远缘杂交常由于胚乳不亲和性而失败。运用胚培养，有可能在人工培养下拯救这种杂种胚并进行培养。胚发育完全在培养瓶里完成，当长到能自养生长时，把它移栽于温室。
另一些方法包括原生质体融合。用酶法把悬浮细胞去壁后，植物原生质体可经机械方法使之融合。有时杂种原生质体能诱导再生细胞壁。如能诱导分裂，常形成愈伤组织。从杂种愈伤组织再生植株，具有二个种的基因组。通过原生质体融合产生了许多种间甚至属间杂种，但禾本科种的杂种还未见报道。
4．种质保存 可是，组织培养对作物育种的最重要效用，可能是外来种质保存。Sala等(1979)提出了用水稻细胞悬浮培养体冷冻保存技术。采用DMSO和速冻技术，做到在最低破伤下保存水稻组织。冰溶后，一个细胞世代内，恢复了指数生长，设想并未发生遗传性改变。能以在保存过程中，进行抗寒性选择。
IRRI保存着O．sativa 60000种系，以及广泛收集的O．glabberrima基因型。组织培养提供着快、省保存罕见和有价值基因型的方法，供分析和利用。
5．育种应用
(1)无水栽培 约占世界稻田面积的1／3。近代半矮秆水稻品种能耐水深最高为15cm。有些较高半矮秆品种能在50cm深水中生存。传统品种能生长于1m水中，而许多浮稻水深可达1．5m以上。
无水稻栽培无灌溉之利，一般栽种传统品种，平均产量1t／ha。只有菲律宾有70%无水田栽种现代品种，越南在湄公河三角洲有30%栽半矮秆品种。未来育种目标：培育耐旱品种，以适应主要生长季内缺水的不利环境。理想品种应具有中间株型，幼苗快速长成高秆，以抗早期淹水；能耐短期淹水；其它如光周期敏感性、早熟、耐不良土壤营养条件等。
(2)深水稻栽培 传统上农民栽种浮稻品种，以适应季风时间的淹水。育种家用深水稻品种与半矮秆品种杂交，从这些杂交后代中选出深根材料，在理想条件下，能保持半矮秆习性。当水平面增高时，其节间能快速伸长，使穗露出水面。但自后水面不能下降，方能取得高产。选种目标，要培育收割前遇水面降低时能抗倒伏的深水稻品种。选择在退化后，能在茎节上发根，收割时期恢复矮秆结构。其它特性如小而直立叶，以增高光合效率；抗钻心虫；高肥反应性。
(3)遗传多样性 最近25年育种家从事于广泛杂交，近年来现代栽培稻遗传基础变得狭窄。Hargrove(1979)分析亚洲水稻育种规划，揭示了1965年，TNl是最普遍的供体品种，占全部杂交的22%。IR-8占20%，其它IRRI品种占总基因库的14%。1975年，其比率分别降低到1%，3%和44%。这是由于IRRI开始将现代水稻基因组引入传统品种的鼓动下造成的。
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