菜豆
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第441页（16567字）
菜豆属(Phaseolus)属蝴蝶花科(Papilionaceae)，有180以上种，其中126种原产美洲，54亚洲和东非洲，2澳大利亚和1欧洲。墨西哥是变异中心，有70种。墨西哥和危地马拉地区，自发生长成野生种(P．vulgaris ssp．aborigineus)。常利用大刍草为自然支持者。野生菜豆是一年生，或很少是短命多年生，攀缘藤生，第一年开花结实。大都种子小，也有大种子的。驯化品种种子较大，荚大，茎粗，或丛生或藤生。有经济重要性的至少有9个种，4种来自新世界，5种来自旧世界。可分干和鲜(绿)菜豆两类。中国、印度和巴西是干菜豆的主要生产国。基于其种皮包、种子大小和形状加以区别。含蛋白质22-23%，高达30%。常含有低蛋氨酸和半胱氨酸。并含有毒物质，煮后可部分钝化。其它种子化合物有碳水化合物(58%)，脂肪(1．6%)，纤维(4%)和灰分(35%)。是硫胺素和烟酸的好给源，核黄素低和维生素A，C和B12很低。
鲜菜豆主产国有中国，意大利和埃及。用于直接消费的，荚较巨大，平或卵形。短、圆荚栽培品种常用于制罐。速冻鲜菜豆特点是剥皮易否。外观、颜色、坚实度、煮后食味。
菜豆是主要栽培种。自交可育，自花受精种，异交常低于1%。育种以取得自交系为目的。异种间杂交遇有障碍时，曾用生长调节剂处理或胚培养予以克服。Al-Yasiri与Coyne(1964)发现萘乙酰氨单用或与赤霉素钾盐配合，能有效地延缓菜豆×蛾豆荚的脱落。棉豆×龙爪豆♂用N-间-甲苯基酞氨酸处理授粉花结了荚。
最重要育种目标是产量，蛋白质质量和数量，消化性，毒物和反营养含量，病虫抗性，抗逆境性。至于耐污染，特别是除莠剂残留、适应机械收获和加工也重要。高产理想株型是植株相对大、节、叶多，树冠有利于截取阳光。蛋白质改进着重于单位面积产量，氨基酸谱，和消化性。高产与高蛋白质含量相组合，显然可得最高单位面积蛋白质生产。二者有负相关(r=-0．30)。玉米的限制性氨基酸是赖氨酸，菜豆则是蛋氨酸。营养学家估计菜豆色氨酸含量要加倍，含硫氨基酸要增加3倍，才能达到供给白蛋白质需要量的24%。Kelley与Bliss(1975)报道蛋白质百分与蛋氨酸占蛋白质百分是正相关，r=0．33。二者可同时改进。豌豆球蛋白百分与可给志蛋氨酸有显着负相关。用蛋氨酸为蛋白质含量指标，可用于培育减少豌豆球蛋白含量，提高菜豆蛋白质的利用。
(一)研究进展
Boulter和Crocomo(1979)发表关于菜豆细胞培养最近发展的评论。Veliky与Martin(1970)用White(1963)，MS，B5培养基，在低和高盐浓度下，都建立了菜豆愈伤组织和细胞培养体。Liau与Boll(1970)提出了用于丛生菜豆幼苗的根、下胚轴、和子叶外植体产生的愈伤组织培养体的固体培养基，和从这些愈伤组织培养体产生的细胞悬浮培养体生长的液体培养基。采用了各种生长因子、有机物质和盐类成分与浓度的不同培养基。细胞悬浮培养体的矿质盐类浓度较低于愈伤组织培养体。最近生长要求椰乳和其它有机物质。根，下胚轴或子叶的愈伤组织产量有差异，但其细胞悬浮培养体稍有差别，从根产生的细胞干物重最高。
Liau与Boll(1971)研究了丛生菜豆(var．contender)下胚轴经系列继代的细胞悬浮培养物的生长周期内的细胞数、细胞大小、鲜重和干重的变化。采用
强度MS盐类加Liau与Boll(1970)的有机物质。加9μM 2，4-D和3μM KIN。在12天生长周期内，停滞阶段不超过48小时，建立了指数生长所需条件。在指数生长期间，细胞数很快增加，形成团块。但这与细胞大小和干重增加，无直接伴生关系。干重增加推迟约2天，只在指数生长阶段多少完成时，细胞开始增大。直到约12天时，细胞未见明显分开，但约16天时，几乎全都游离了。取7日龄细胞，每隔5天重复继代，可保持继续细胞分裂状态。平均有丝分裂周期少于24小时。
菜豆细胞培养体中，在批量繁殖的细胞培养体中，多数产生初级细胞形式。没有一种生长模式引导成规定的类胚结构，或游离的或成细胞团。短纤丝形成细胞团早期，状如幼胚，细胞簇位于纤丝一端。可是，这些细胞簇长成团块，而非有组织胚。细胞纤丝一端形成团块，指出这些纤丝中存在生理学极性。细胞团块可在二端形成或沿着细胞纤丝全面形成的事实，表明并不存在固有极性。这种缺乏固定极性和其采用的培养基，说明不存在类胚形式。适当掌握培养基，可用以诱导这种细胞培养体的器官建成和胚胎发生。
1．需要的生长因子 Mok和Mok(1977)评价了菜豆，棉豆和蛾豆的7基因型对生长素的反应。采用MS。合成生长素picloram有效地促进菜豆属愈伤组织生长。浓度适宜范围广(1．25-40μ，M)，在合适用量下，细胞质量好。2，4-D也有效，对4基因型的最适浓度为1．25-20μM。高于1．25μM时，对其它3基因型愈伤组织生长有抑制作用。NAA10-40μM诱导愈伤组织生长，IAA无效，早期观察到这种组织的褐化。
Mok等(1980)研究菜豆和棉豆愈伤组织培养体需要细胞分裂素的差异。愈伤组织启动用MS+Picloram 2．5μM和KIN 5μM。在MS+5μM KIN继代一次后，进行细胞分裂素自养测验。10个菜豆基因型中，1个的愈伤组织生长高细胞分裂素，6个在无细胞分裂素培养基上能中度生长，3个则在不加细胞分裂素时生长良好。棉豆10个基因型中6个需细胞分裂素，4个在无细胞分裂培养基上愈伤组织生长不规则。菜豆愈伤组织的行为无组织来源和培养时间无关。
研究菜豆严格依靠和独立基因型间杂交F1，F2和BC1组织培养对细胞分裂素要求的遗传结果，指出需要细胞分裂素特性可能受一组等位基因的调节。
M．C．Mok等(1978)研究8种细胞分裂素在促进菜豆属二种基因型愈伤组织生长中的活性。类异戊二烯N6侧链的2，3位上的双链存在与否担负着对主要基因型发生差异的细胞分裂素结构-活性关系。就B．lunatus var．kingston言，反式玉米素和2ip或活性相等或比带有相应的饱和侧链诸细胞分裂素活性更大。就P．vulgaris cv Great Northern言，2ip和反式玉米素的N6侧链的双键的存在，与二羟玉米素和2 ip相比，其活性强烈降低。当用2，4-D代替Picloram作为生长素源时，细胞分裂素活性并未受到影响。自然产生的二羟玉米素是作为一种游离碱基或可能作为核苷存在于P．vulgaris var．pinto。
Bennici等(1976)报道龙爪豆胚柄近端部分培养在无生长素的，高浓度蔗糖(12%)培养基的愈伤组织生长。愈伤组织形成经无丝分裂而启动。无丝分裂之后，随之发生前次无丝分裂和胚柄里已有的正倍体细胞核产生的核的有丝分裂。胚-胚柄复合体整体性，对愈伤组织形成有重要性。通过无丝分裂随之有丝分裂形成愈伤组织，是生长在不加KIN的或生长素：细胞分裂素比率不平衡的培养基的组织培养的特征。核染色体断裂随之有丝分裂是染色体数广大变异的机理。
2．生物转化和代谢产物生产 包括游离植物细胞培养及其代谢、活跃生长的培养体研究是需要的。Veliky与Martin(1970)建成了培养菜豆细胞的发酵罐。Bertola与Klis(1979)改进一种商业用细菌发酵罐，容许在规定pH中，受葡萄糖限制的菜豆细胞的连续培养。这种方法由于细胞能恒速和生长在恒定成分的溶液中。由此细胞能以无限期地保持特定代谢速率。
Veliky(1972)和Veliky与Barber(1975)发现菜豆细胞悬浮培养体具有转化色氨基酸为生物碱哈尔碱和非哈尔碱的生物合化潜力。植物根(活体上未知其有产生生物碱的能力)建成的细胞培养体，在加色氨酸人工培养基上，将产生哈尔碱和非哈尔碱。由此可知，菜豆细胞培养体可用于生产有用的代谢产物。
Mante与Boll(1975，1978)研究椰乳，2，4-D和KIN对细胞外多糖生产的影响(用菜豆品种Contender的细胞培养体为试材)。椰乳与完全合成培养基相比较，对自然糖成分影响很小。单用2，4-D比单用KIN生产更多细胞外多糖。对照培养基生产最低。当只加KIN培养基上，恒定生长阶段，细胞外多糖生产很少。这可能指出细胞分裂后细胞外多糖生产，2，4-D的影响大于KIN。
Mante和Boll(1976)分析培养周期对单项细胞外多糖组成(冷水可溶性果胶，EDTA可溶果胶和天然多糖)的影响。果胶内的中性糖，与变化小的天然多糖中糖浓度相比，在培养周期内出现相当大的波动。
Bassiri和Carlson(1978)研究了菜豆植株材料和诱导植株组织产生的愈伤组织的同工酶谱。虽然酶系统如过氧化物酶，果糖脱氢酶和酸性磷酸酶是个别器官专性的，从不同植株部位启动的迅速生长中愈伤组织的同工酶谱，观察到大的一致性。这对作物改良有重要性，由于许多遗传选择和人工培养下农艺特性的快速检测，需要组织专化特性的细胞表达。
Arnison和Boll(1974)从事从单个幼苗产生的根、下胚轴和子叶愈伤组织培养体的过氧化物酶，多酚氧化酶，过氧化氢酶，果糖和谷氨酸脱氢酶，酯酶，亮氨酸氨基肽酶的电泳分析。在培养周期中，酶谱改变，某些同工酶只在一定时间出现。三种培养体的同工酶谱很相似，但观察到它们之间有些持久差异。
用根、下胚轴和子叶悬浮培养体的提取物为材料，Arnison与Boll(1975)发现了酸性磷酸酶、过氧化物酶和果糖脱氢酶的同工酶含量与活性有相当不同。结论是特定组织的分化，可能包含着不可逆变化。
Arnison和Boll(1975)研究结果，与Bassiri和Carlson(1978)的相比，这种矛盾可能反映着供试遗传材料不同，和试验条件不同。
Arnison和Boll(1978)研究了生长因子如2，4-D和KIN各种酶的同工酶谱的影响。生长在有、无生长调节剂的细胞的同工酶谱差异显然是数量化的。可是，某些次要同工酶，只有在生长于有、无生长调节剂的培养体才能测出。
将菜豆愈伤组织从加2，4-D的保持培养基转移到诱导培养基(加NAA与KIN)后，研究苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)，咖啡碱-O-甲基转移酶和过氧化物酶活性。生长在保持培养基上的愈伤组织里PAL活性最高峰，转移到浓度减低到半数以下的诱导培养基后，可保持恒定6-35天。愈伤组织转移到或诱导培养基或保持培养基后，咖啡碱-O-甲基转移酶活性3-9天间上升，在保持培养基上15天后，其活性降低到启始水平。在诱导培养基上，9-15天间活性保持稳定，然后缓慢下降，至少5周内仍显着高于在保持培养基上的活性。愈伤组织生长在保持培养基上，过氧化物酶活性保持常数，转到诱导培养基后迅速降低。当诱导培养基附加ABA(30μM)时，PAL活性增高。
3．形态建成 Crocomo等(1976)用含Veliky与Martin(1970)盐类和维生素培养基+10g／L琼脂，11．2μM IAA，5．4μM NAA和0．9μM KIN培养菜豆叶切片。菜豆种子先浸入自来水2h，然后磨成匀浆，提取水浸液，以占种子的
浓度／ml加入培养基。9供试培养体中，诱导产生再生植株2株。
Rosetti与Allavena观察到体细胞胚胎发生。选系P263(抗BCMV．)用于预准试验。取8日龄幼苗初生叶培养在120m1瓶内，含有B5+18μM 2，4-D。20天后，愈伤组织转移到10m1液体培养基中，放在振荡器上。二次培养基用B5盐类、糖和维生素，加0．53μM NAA，2．3μM KIN，0．29μM GA3，和0．11μM ABA。培养在扩散光下，光周期16∶8，25±0．5℃。在二次培养基上培养10-12天后，有些瓶内有少数胚出现。尚未能取得成熟植株。由于培养在其它培养基上菜豆组织，也曾看到退化的类胚结构，应进一步鉴定菜豆体细胞胚胎发生的GA3与ABA的确切比率。
Peters等(1976)研究咖啡碱和尼古丁对菜豆品种Bicode Ouro组织培养愈伤组织生长和根器官建成的效果。用四种培养基测验尼古丁的影响：基础培养基(BM)(改进的Veliky和Martins+11．5μM IAA+1μM KIN)，BM不加KIN，BM不加IAA和KIN。在BM上，尼古丁抑制根启动。BM-KIN，它不能促进愈伤组织生长，但有根诱导。BM-IAA-KIN，它不能刺激愈伤组织生长或根形态发生。咖啡碱颉颃着愈伤组织生长和根形态发生。
Tonin等(1982)研究氨基酸对菜豆细胞培养的影响。MS(营养溶液)+46μM KIN+28．5μM IAA和3种氨基础：精氨酸0．34mM，天门冬氨酸0．37mM和异胱氨酸0．08mM，促进了最适根形态发生。同样培养基附加0．44mM谷氨酸，0．33mM甘氨酸和0．06mM组氨酸抑制生长和形态建成。低浓度3．4μM谷氨酸促进愈伤组织生长，高浓度(0．44mM)则有抑制。Crocomo等(1976)发现了玉米素(0．2-0．45μM)对根形态建成有刺激效果。
Jeffs和Northcote(1967)发现了在培养基附加2，4-D和含IAA和蔗糖或某些葡糖苷双糖如海藻糖和果糖的楔形物上诱导产生的愈伤组织中分化斑。在楔形物中含IAA和蔗糖时，或用只有蔗糖的楔形物代替只有IAA时，发现有完整的维管束的瘤，木质部居中，韧皮部在外，中间是形成层。如用蔗糖启动，随后加IAA，只诱导出木质部痕迹。IAA诱导的有丝分裂和幼细胞，蔗糖能促进其进一步分化，在残留IAA存在下，蔗糖诱导细胞增大加二次加厚。如不加IAA时，给以蔗糖，立即为细胞用于代谢并以淀粉形式储存。楔形物里只有KIN，刺激细胞分裂；IAA和蔗糖存在下，能促进细胞分裂和分化。
在规定保持培养基附加9μM 2，4-D和0．058M蔗糖启动的菜豆愈伤组织转移到诱导培养基5．4μM NAA，1μM KIN和0．088M蔗糖后，曾诱导出根和维管束瘤。移到诱导培养基前，愈伤组织曾在保持培养基上转移3-6次。在保持培养基上继代初期(第4次继代)，根分化消化，第6次继代时，形成瘤。曾用PAL和1-3葡聚糖合成酶活性，作为维管束分化的生化指标。
NAA与KIN在诱导培养基里发生互作。在PAL活性增高前2天，NAA的最适需量为5．4μM。KIN导致快速刺激PAL诱导速度，在0．5-2μM浓度范围内，产生了PAL全量。10．7μM NAA对PAL诱导有抑制作用，增高KIN浓度可予克服。
Haddon与Northcote(1976)研究了GA3和ABA对组织和细胞分化的影响。ABA在培养基内浓度高于1μM，抑制了二者的分化。培养在含30μM ABA培养基上9天后，抑制显出充分和不可逆。加GA3对这种抑制作用无影响。一旦分化启动，继之转移到含ABA培养基上，不会抑制瘤的正常发育。
在生长素与细胞分裂素适宜比率下，GA330-45μM刺激有组织发育不加KIN，GA30．1-30μM促进根形成。在正常不能诱导分化的生长素：细胞分裂素为50∶1下，加GA3出现生根。GA3对形成维管束因素的效果，视所用浓度而定。诱导培养基加GA3增长瘤形成前的滞留期。GA345μM抑制细胞分化速率和推迟其启动。
供试组织的形态建成潜势，其产生的愈伤组织中并不能保持。经在保持培养基上4次继代后，将不同植株部位的愈伤组织转移到诱导培养基，诱发形成相等维管束瘤。只有花药培养产生的愈伤组织，形成了显着大量维管束组织。
保持培养基加椰乳时，能诱导发生的根和维管束瘤的转移体数增多。椰乳增加了分化所必需的二倍体细胞比例。KIN不能代替椰乳，由于潜力消失得到部分阻制，但培养体倍数性无影响。椰乳组分与KIN不同，明显促进着发育细胞的分裂。其它因素如细胞-细胞互作，对决定培养体形成维管束能力有重要性。
测定PAL活性量，研究菜豆悬浮培养体内形态建成潜力的消失。组织生长于两类培养基中：第一，附加2，4-D作为唯一生长培养基；第二，附加2，4-D和椰乳。当细胞生长在2，4-D培养基5-10次继代，取样在各种间隔时间转移到诱导培养基加5．4μM NAA和0．93μM KIN，诱导产生的PAL活性量和木质部数逐渐下降。生长在加椰乳培养基的细胞，诱导PAL或木质部组成的能力并未消失。显然，细胞选择不是遗传改变，是诱导力消失的致因。诱导现象的变化，似与诱导培养基附加的荷尔蒙细胞反应的可逆变化有关联。由于细胞能产生内源生长因子，可能发生一种情况，在继续生长期间和不同培养基，这些生长因子和它们的比例可有变动。由此，细胞内生长素与KIN含量，可能决定着PAL浓度，后者依靠于内源和外源荷尔蒙。所以，有可能失去诱导力的细胞，将对不同外源生长素和细胞分裂素浓度发生反应。可是，细胞内的其它变化将能以设想，由此它们不再对任何浓度的外源生长荷尔蒙发生反应。
4．雄核发育和单倍体生产 Haddon与Northcote(1976)首次描述了菜豆花药培养产生愈伤组织。培养基为B5加0．058蔗糖+9μM 2，4-D单用或与1．9μMKIN或20%椰乳(v／v)相配合。单核和二核花粉粒的花药培养2个月后产生愈伤组织。加KIN，20%花药启动愈伤组织。其外表与生长率，与来自其它植株部分的相似，但能长期保持分化维管束的潜力。
Peters等(1977)观察了生长在Veliky与Martins培养基附加4．5μM2，4-D单用，或与5．4μMNAA，11．4μMIAA和0．9μMKIN相配合的花药产生愈伤组织的发育。试验温度是25℃和30℃。在加或不加2，4-D培养基上，产生愈伤组织花药百分数相同，但在2，4-D培养基上，愈伤组织数加倍。30℃抑制愈伤组织诱导和生长。细胞学分析指出单倍体和二倍体细胞数近于相同，多元体少于3%。
菜豆悬浮体生长在无荷尔蒙培养基的愈伤组织细胞的细胞学分析指出，染色体数差异很大。约28%细胞有11染色体，但没有明确论据，可证明这些细胞是真单元体，由于不可能进行精确的核型分析。无丝分裂(核断裂)随之有丝分裂可能是染色体变异性的致因。
5．微繁殖和茎尖分生组织培养 Allavena与Sharp(1981)将二个菜豆选系顶芽人工培养微繁殖成功。用MS附加20-40μM BA与2-50μM IAA或2-5μM NAA相配合产生了复芽和不定芽。当将小芽簇转移到相同培养基上，茎芽进一步发育。将茎芽簇转移到B5加0．45μM BA，产生了根形成和较长茎。移入土内的再生植株能开花结实。
Kueueman(1976)用菜豆在无菌条件下，从种子吸涨4天的顶盖取出约0．5mm长的分生组织，接种在B5固体培养基上。结果指出1μM NAA促进而0．2μM BA抑制根的启动。
Ka rtha等(1981)研究一些豆科的茎尖分生组织再生潜力。普通菜豆品种矮绿无筋的种子经表面消毒后，放在无菌110ml玻璃的湿棉布上发芽。发芽后4-6天，取茎尖分生组织和邻近组织长约0．4-0．5mm，具有一对叶原基，无菌切离，培养在装有2．5ml MS盐类加0．088M蔗糖，B5维生素和8g／l琼脂的小试管内。加不同组合和浓度的BA和NAA。26℃，光周期16h，光强7000lx。在单纯基础培养基或培养基附加1μM NAA上，分生组织分化成生长旺盛植株。当其培养在各种浓度和组合的BA和NAA上时，未见再生完整植株，在加1-10μM BA或5μM BA与10μM NAA培养基上，再生了复芽。单加BA的，则以10μM分化最高(每分生组织15-30芽)。加0．1μM BA时，分生组织再生直接成单茎长2-3cm。转移到加1μM BA，0．1μM NAA和0．1μM GA3的培养基后20天，复茎伸长到约2．5cm，未分化根。将伸长的茎培养在
强度MS加1μM IAA诱导生根成功。再生植株移栽到土中后，生长到成熟。
6．胚培养 Raghavan(1977)发表了胚培养应用概略评论。菜豆胚培养研究，目的在于克服杂交不生存性和了解种子生物学。
Hanma(1955)在豆荚出现败育征状时，取14-24日龄异种间杂交胚(菜豆×蛾豆)培养，含0．12M蔗糖的White液体培养基，能满足根和芽发育，再生植株移到降低蔗糖浓度培养基，移进钵上。取得完全可育植株。加椰乳、烟酸和维生素B1，培养基效果未见改进。
Braak与Kooistra(1975)以转移P．ritensis的耐低温特性为目的，进行了菜豆×P．ritensis杂种胚培养。采用Tomaszewski和White培养基。White+0．088M蔗糖培养很幼胚生长较好；较老胚生长以0．014M蔗糖的较快。Honma(1955)观察到杂种胚以Tomaszewski固体培养基加0．12M蔗糖生长最快。加1g／L水解酪蛋白加速0．7mm胚(无子叶)的生长，0．7mm以上胚生长推迟。
Alvarez等(1981)借助于胚培养进行菜豆属内种间杂交，包括龙爪豆×蛾豆，龙爪豆×菜豆；菜豆×蛾豆；F2(菜豆×龙爪豆)×蛾豆。
D．W．S．Mok等(1978)研究谷酰胺和GA3对未成熟胚的效果。MS无机盐类附加有机物：0．088M蔗糖，肌醇0．55M，盐酸硫胺素3．0μM，烟酸40．6μM，和盐酸吡哆醇2．4μM。加谷酰胺0．07mM或0．7mM和GA30．1μM。谷酰胺对杂种胚生存有益，尤其是很小的胚(小于0．3mm)。GA3未见改进生存。胚培养技术也曾应用于取得旧世界种间杂种。
7．原生质体 Pelcher等(1974)用P．vulgaris var．pinto叶组织(初生叶和三小叶叶)取得高产原生质体。直接从温室取的植株制备原生质体，残屑相当多。把植株放在23-25℃，相对湿度45-48%，光强200-400lx下24h，取得原生质体高产。酶混合液是0．3M甘露糖醇，0．25%脱盐纤维素酶和0．25%果胶酶。pH7取得稳定原生质体生产效果，有生活力原生质体最后产量显着高于pH5或6。
分开残屑后，离心收集原生质体，洗3次，悬浮在B5附加0．3M甘露糖醇，0．1M葡萄糖，0．1g／L水解酪蛋白，6．8μM CaCl2·2H2O，3．3mM核糖，3．3mM木糖，0．7mM羟-L脯氨酸，4．5μM 2，4-D和9．3μM KIN。新制备的原生质体核接近于质膜和叶绿体围着核形成一簇。分离后24-28h，核位于中央，叶绿体经胞质环流开始分散在细胞质中。染色指出分离后24-28h，细胞壁物质围着原生质体沉积。培养2周后，每个微滴上加等体积新鲜培养基。1个月后，细胞悬浮体转移到B5加4．5μM 2，4-D和9．3μM KIN的琼脂板上。愈伤组织形成后，除去KIN。
(二)培养程序
1．菜豆叶外植体的形态建成
(1)从2周龄植株上取叶，放入20%次氯酸盐表面消毒15min。蒸馏水淋洗2次。
(2)切消毒叶成5mm方块，培养在试管中，装10ml营养培养基。
(3)培养在恒常条件下，25℃，光周期12h，光强200英尺烛光。
(4)8周内观察第一个再生芽。
营养培养基：
67-V盐类和维生素(Veliky与Martin，1970)
菜豆种子提取液：1／4种子／ml水(在通气水中浸2h，然后磨成匀浆)。
IAA 11．0μM，NAA 5．4μM，KIN 0．9μM
pH4．5，1%琼脂。
2．菜豆原生质体分离和愈伤组织形成(Pelcher等，1974)
(1)植株应保持在23-25℃，相对湿度45-48%，光强200-400lx下至少24h，备用。
(2)9日-5周龄植株的叶，放入10%商品漂白粉加0．05%吞温805min，然后浸入70%乙醇2min。用0．3M甘露糖醇淋洗2次。
(3)将叶切成5×5cm小片，用镊子撕其下表皮。
(4)将撕去部分放入8ml消毒0．3M甘露糖醇，0．25%脱盐Driselase和0．25%果胶酶，pH5-7。暗培12-18h，23-25℃。
(5)用88μM不锈钢筛过滤，将原生质体与残屑分开。100×g离心3min，收集原生质体。
(6)用离心和再悬浮3次，洗原生质体。
(7)将洗过的原生质体再悬浮在B5加0．3M甘露糖醇，0．1M葡萄糖，0．1%水解酪蛋白，6．8μM CaCl2·2H2O，3．3μM核糖，3．3μM木糖，0．76μM羟-L-脯氨酸，4．5μM2，4-D和9．3μM KIN。
(8)将原生质体培养在50μl微滴中，每毫升密度5×l0原生质体。
(9)将原生质体制品培养在湿箱中，23-25℃。分离后24-48h，应发生细胞壁再生。
(10)培养2周后，加新鲜培养基，然后每周加一次。
(11)培养3-4周后，细胞可转移到琼脂培养基。
(三)展望
Crocomo等(1976)取得了二株和Rossetti与Allavena取得了体细胞胚，提出了将来研究方向。控制根形态建成的因子知之较多，但芽形态建成和体细胞胚胎发生尚乏了解。对于经愈伤组织或细胞悬浮体再生植株的原生克隆，和胚培养产生成熟植株的技术，均需加强研究。
原生质体融合、雄核发育和选择核和细胞质突变体(例如抗病性和生物合成含硫氨基酸、色氨酸和赖氨酸的非调节酶)实践应用技术，尚待发现。采用培养茎尖芽或分生组织营养繁殖技术有下列应用价值：(1)诱导核和细胞质变异，(2)从嵌镶组织分离纯系突变体，(3)特殊基因型(雄性不育，自交不亲和)的营养繁殖，(4)产生和繁殖无病材料，和(5)种质冰冻保存。
培养异种间菜豆幼胚已有合适技术。关于新世界菜豆和旧世界菜豆种间受精可能性，已有许多报告。二群种间杂交似更困难。用生长因子处理雌株豆荚和未成熟胚离体培养，使之能以克服不亲和性某些障碍。菜豆种间杂交主要目的，在于便于把野生种基因转给栽培品种。抗病、旱、低温气候；高蛋白含量；改变氨基酸成分；和植株结构，都是育种家需要转移的一些特性。考虑到菜豆在人们营养中的重要性和组织培养方法对菜油遗传改进的潜力，应加强努力为之。
【参考文献】：
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