林木
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第639页（10737字）
本文集中讨论木本双子叶种，和曾经取得组织培养成果的种。有些是灌木而不是乔木树，其它是观赏植物或用于食料生产而不是造林树种。
(一)研究进展
曾用各种方法繁殖树木(表25-1)。大多数是过去5年的研究结果。一般用幼年外植体，和多种外植体源。下文叙述三种主要种类：杨属、按树属和其它木本双子叶植物。
Gautheret(1940)报道美国榆形成层培养物形成不定芽。Jacquiot(1949，1951，1955)报道美国榆和其它几种的类似现象，有些生根，但未见根和茎叶同时发育。
1．杨属 Mathes(1964)，Walter(1968)，Winton(1968)报道杨属植株再生。Winton(1970，1971)证实了能取得正常植株，但频率低。自后许多学者研究杨属组织培养，有些涉及器官发生，及荷尔蒙的控制作用，培养基成分，培养器官的供源和发育。采用了愈伤组织培养和微繁殖。Berdee等(1972，1976，1977)采用组织培养与热处理相配合，以解救选择的Aigeiros白杨无性系的衰退。取茎尖愈伤组织诱导再生茎叶，然后生根。移植苗圃。提出设有一种培养基系列能成功地应用于全部克隆，1／3愈伤组织生茎叶。同一亲本的一些无性系株高有显着差异，同一茎尖产生的愈伤组织和同一愈伤组织产生的无性系间也是如此。许多再生植株染色体数在正常范围内，但是，8／46无性系从单倍体到四倍体，包括许多非整倍体。由此可能取得染色体畸变和某种程度的病毒侵染。Chalupa(1974，1975)从愈伤组织产生杨属再生植株。其中86%分化茎叶。他用无菌真珠岩-沙或真珠岩-沙-泥炭混合物作为生根基质，产生良好根发育。再生植株移植钵中。Chalupa(1977)比较研究再生植株产生的与亲本树产生的愈伤组织。同一母树产生再生植株生长率相似，颜色、叶形和大小和光合率相似。染色体数与母株相同。未见Berdee发现的变异性。
Rious等(1975)液培Populus enramericanacv．Robusta取得松散愈伤组织。经过滤和离心取得游离细胞悬浮体，植板在培养皿的琼脂上。产生的克隆转入试管，诱导茎叶分化，切取茎叶以求生根。每一步骤需要不同培养基。
Whitehead等(1976)研究快速微繁殖应用于繁殖黑杨Italica，P．“Flevo”(加拿大白杨×黑杨)和云南白杨。取腋芽，表面消毒，接种在萌芽培养基。待芽萌发和茎叶伸长，把茎叶切成0．5cm切段和再培养。离体腋芽生长，也形成不定芽。人工培养或活体生根。3个月内再生植株高1-1．5m。由此采用此法可在短时间内，能产生大量茎叶。Christie(1978)以生产2万再生植株抗锈病白杨供种植用为目标。他改进培养基，促进了不定茎叶或茎叶产生腋生分枝。不定茎叶小，难于掌握。4-6周继代一次，能增加腋生分枝的产生。每芽建成培养系后，每月可得10茎叶。其中80%生根良好。提出了锻炼方法，3个月内长到高1．5-2．0m。Chalupa(1979)应用同法于其它森林树种。可见杨属的若干种应用微繁殖可望成功。
2．桉树属 Aneja和Atal(1969)发表的桉树组织培养引述最广，虽然关于培养基叙述不全，形态论据差。自后发表的培养基有所差异(Lee等，1974)。
Cresswell等(1974)采用E．grandis幼苗切节培养繁殖。主要报道了切节培养根发育的解剖研究。Cresswlle等(1975)继续用14节以上E．grandis分枝节培养，这是生根切节的最高节。浸2h，以除去抑制剂30%节产生腋芽发育和根启动。de Fossard等(1976)扩大到应用于美丽桉树成年树。有些节培养体产生多芽，但在成年组织上未能生根。Barker等(1977)用改良的培养基，取得成株节生长更为旺盛和多芽形成。反复继代，在除去全部成年组织后，从芽产生茎叶。再者，E．ficifolia，E．grandis，E．regnans和E．polygrcctea的成年组织繁殖均未获成功。de Fossard(1978)取得相当大进展，用美丽桉树幼苗材料繁殖茎叶和生根。成年茎叶繁殖并有改进，但成年茎叶生根，伴随着茎叶退化。
Kitahara等(1975)取得了E．alba的茎叶，但根发育差。Sita(1979)试用E．citrio-dora幼苗部分繁殖茎叶。只产生了再生植株。成树未见分化。Hartney等(1980)报道桉树10个种幼苗取得多茎叶的方法，其中5株生根。有些已长了2年。最近，E．citriodora 20年生树经组织培养繁殖。用20年生树顶芽和腋芽为外植体，在特定条件下，30%确能产生5-8茎叶。能用于继代。经4次继代后，35-40%生根。大田成活率40-50%，共得22株。
Boulay(私人通讯)提出桉树属培养繁殖方法。可产生10万株供大田种植。至今已取得4万株代表108无性系，尚不能作用商品繁殖的推荐方法。
3．其它木本双子叶植物 许多其它木本双子叶植物组织培养反应出器官建成。有些取得体细胞胚和再生植株。大量园艺树作物也用离体培养繁殖。兹举例示之。赤杨和榆用了愈伤组织培养，取幼苗为外植体源。赤杨选出一年生开花，此时期只有生殖芽。培养后，在第二生长阶段出现营养芽。这些结果提出有价值问题，涉及从幼年到成年间的阶段变化，和利用组织培养使组织回复到幼年状态。愈伤组织也各别分开诱导产生胚胎发生。
最近几年来微繁殖用于大量木本植物繁殖。腋芽或顶芽用作外植体，用载培粟胚性轴为启动材料。轴上分化的腋芽发育成再生植株，是繁殖阶段最常用的。并能保持遗传稳定性。白桦系统是微繁殖的好例子，由于繁殖的茎叶已能在混合钵土中生根，锻炼和移栽大田。第一年结果证实了组织培养产生的白杨再生植株，移栽大田立即进入休眠，由此其生长比相同种子产生的幼苗为慢。但其株高更为一致。Gupta等(1980)用柚木的研究，100年生树能用作外植体源。其繁殖率不如幼苗外植株的高。Sommer等用成年麻栗材料，第一到第二次继代生根百分从10%增至60%。这代表着还童或生根率选择，详见表25-1．
表25-1 组织和器官培养再生植株的木本双子叶森林树种
a．M=成年；J=幼年。
(二)培养程序
1．胚胎发生 组织培养产生体细胞胚比器官发生在繁殖实践上有几种优点。常能控制悬浮培养物的生长、繁殖和分化。或将悬浮物植板，在琼脂上完成分化。无论用什么方法，悬浮培养能从母株培养物快速繁殖，节省分株繁殖之劳，由于每瓶有产生上千再生植株的潜力。还可设想胚能加以包埋，当作种子处理。Haecius(1978)提出胚(合子或非合子的)的定义：从单个细胞产生的新个体，与母体组织无维管束相连接。单个细胞的来源难于证实。但是胚的解剖特征是存在着分开的根状的末端(维管束状密接亲体组织)，不难区别。还有胚的生长而形成功能的再生植株。
Rao(1965)最早报道用檀香培养产生胚胎发生。胚易于同亲体分开。胚具有易识别的根，但胚性茎叶发育很差。未能得到功能性植株。
Hu等(1972)报道枸骨叶冬青子叶上产生体细胞胚条件不同寻常，合子胚子叶上发育的胚，培养在LS基础培养基上，未能长成茎叶和正常子叶。愈伤组织形成不明显。解剖研究指出与亲本组织无维管束连接。胚解剖特征正常，在特定条件下，能以发芽。Hu等(1978)指出有些胚是双色的，相当于背景子叶组织的双色部分。这就提出胚可能不是单细胞起源的。
另一种很有价值的木本植物非合子胚胎发生研究。早期报道采用光学和扫描电镜，这些研究透射电镜。Carylus auenlana和日本泡桐从合子胚取得了胚性愈伤组织或从日本泡桐的未成熟胚珠诱导产生。加2，4一D时再生植株形成受抑制，C．avenlana比日本泡桐更为强烈。在透射电镜研究中，他们发现二个种的胚性组织内有有规律排列的膜结合核糖体。这类排在植物细胞内很少报道。从已报告过的情况看，即羊齿卵受精后和活跃分泌腺，它与这些细胞重组织的生长模式或高合成能力相关联。
再生植株没有发现这些内质网(ER)模式，但组织化学研究，指出这些可能分化胚状体的分生组织细胞，能连续合成淀粉，富含糖类、脂质和蛋白质。有可能这些有规律的内质网排列与细胞的胚胎发生的感受性相关连。
体细胞胚胎发生的全部问题并未阐明。洋长春藤幼年和成年类型都在培养下生长。培养物暗培3个月，然后转入光培。幼年愈伤组织形成了茎叶，而老年愈伤组织在White培养基上，加活性炭，形成了胚。老年愈伤组织在不加活性炭培养基上，不分化。发育产生的再生植株表现幼年特性。
2．花药培养 多年来硬木种花药培养未获成功。表25-2列出少数报道，如Zenkteler等(1975)诱导产生单倍体愈伤组织，其他学者如Sato(1974)报道从花药培养体愈伤组织分化产生再生植株。它们证明是二倍体。1975年以来，发表了白杨花药培养产生单倍体。黑龙江森林研究所(1975)报道大青杨和小叶杨×黑杨的单倍体再生植株。Wang等(1975)报道黑杨花药培养体产生的单倍体。前者从愈伤组织取得。用杂种材料，33．8%愈伤组织是从花粉产生的。6再生植株的染色体数检查结果是单倍体。Zhu等(1980)培养杨属14个种，取得了400再生植株，大都是单倍体。
表25-2 花药培养产生再生植株的木本双子叶树木种
由于愈伤组织可能产生嵌合植株，着眼于小孢子直接雄核发育。值得注意有2个报告：Radojevic(1978)用欧洲七叶树花药培养，借助于光学和电镜，证实了再生植株和胚状体是来自小孢子。中期核型是单倍体。后来(1980)发表了发育中胚的超显微结构研究。还从Chimonanthus praecox取得花粉再生植株。橡胶树小孢子直接雄核发育也已成功。
3．原生质体 表25-3列出硬木种原生质体培养，大都用叶肉为供试源。Wakasa(1973)能从Prunus叶分离原生质体。Saito(1976)报道泡桐和Populus euramericana叶取得高产原生质体。Saito(1980)用PEG取得不同品系的泡桐属和杨属与泡桐的1∶1融合。Reden-baugh等(1980，1981)用榆花药培养的广泛研究，包括从花粉母细胞、四分体和小孢子分离原生质体，以产生榆树杂种。配子体原生质体不再生细胞壁，榆体细胞原生质体不产生细胞壁。曼陀罗属(草本种)与树木种融合再生杂种植株是迄今报道的唯一例证。
表25-3 树木原生质体培养文献
(三)展望
硬木树种组织培养特点是大都用幼年组织取得成功，成熟组织极少报道。需要研究的是再生植株的锻炼程序，易于控制胚胎发生和雄核发育，以进一步研究原生质体技术。
园艺作物组织培养微繁殖产生新奇有价值变异体，森林树种组织培养再生植株能以大量供应种植。为此需要了解双子叶树的遗传学和生理学。
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