烟草
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第724页（14907字）
烟草属(Nicotiana)由66种组成，原产于南美洲和澳大利亚。普通烟草是双二倍体种，未见其野生型，假想为林烟草与绒毛状烟草间的天然杂种。有许多类型。其它种的利用目的与此相同，但有一定局限。在国际烟草生产中，黄花烟草占次要地位，在苏联和印度有地区重要性。早先澳大利亚土着居民嘴咀N．Sμaveolens叶。
商品烟草虽原产新世界，澳洲和美洲野生种代表着许多重要农艺特性的渊源，例如，迪勃纳氏烟草能抗许多种病害。曾利用粘烟草抗烟草嵌镶病毒(TMV)掺入栽培品种。长花烟草曾用作抗野火病源。普通烟草×长花烟草产生了选系TL106。与普通烟草White Burley回交，育成品种Burley21。后者用于把野火病抗性转移给其它栽培品种。Burley49具有从三个野生种的抗病因子：迪勃纳氏烟草的黑根腐，长花烟草的野火病和粘烟草的TMV抗性。
烟草产地遍及全世界。以北美洲最多，其次中国、印度和巴基斯坦地区和巴西。10年来世界烟草产量并无显着增进。
(一)遗传学与作物改良
烟草遗传和细胞培养研究历史很久。Kostoff(1943)和Goodspeed(1954)异种间杂种的先驱工作最值得注意。Murushige与Skoog(1962)在烟草常规繁殖中创见了培养基(MS培养基)。花药培养普通烟草与林烟草产生了单倍体植株。Nagata与Takebe(1971)首次从普通烟草原生质体再生植株。Carlson等(1972)从粉蓝烟草+长花烟草原生质体融合产生了第一株体细胞杂种。他从普通烟草单倍体的诱变的细胞培养体分离出第一个营养缺陷体。用普通烟草最广泛地完成了人工培养下分离出的突变体的遗传分析。用普通烟草或烟草野生种之一，开发了许多组织培养技术。Lloyd(1975)从这种杂种子叶愈伤组织再生了植株，由此能把N．suaveolens的褐斑病抗性转给普通烟草。Nakamura等(1974)用F1杂种花药培养育成了黄色烟草品种MC1610的抗病选系。用胚珠培养取得的内索非拉烟草×普通烟草有性杂种产生了黑杆病抗性。内索非拉烟草+普通烟草体细胞杂种观察到TMV抗性。Chaleff与Parsons(1978)在细胞培养体中直接选得除莠剂picloram抗性。采用人工培养下分离突变体，直接得到野火病抗性普通烟草系。还有，在离体培养下选择蛋氨酸磺氧胺抗性，这种抗性植株超产蛋氨酸(野火病毒素的类似物)。
细胞培养也可能控制普通烟草生物碱含量。根据体细胞克隆变异，经组织培养常规植株再生后，生物碱成分变异，有可能从鉴定克隆系发现。此外，胚拯救和原生质体融合可产生杂种，由此掺入野生种的合于需要的生物碱成分。烟草的65野生种，代表着改进烟草的主要遗传源。其中许多与普通烟草有性不亲和，无论是单向的或双方的。但采用组织培养，例如胚培养和原生质融合，可得益于野生种。
(二)研究进展
1．植株繁殖 自从Skoog与Miller(1957)经典研究以来，烟草曾用做典范系统，进行人工培养下再生研究。已取得人工培养再生成功的种如表27-7。
表27-7 离体培养繁殖的烟草种
栽培烟草品种代表着最早用于人工培养操作材料。最常用的培养基MS，是烟草生长试验结果产生的。生长素与细胞分裂素效果十分突出，并可重现。从其叶或茎外植体曾启动了愈伤组织，用MS附加4．5μM 2，4-D和2g／l CH测试了全部烟草种。MS+其它荷尔蒙用量，例如11．4μM IAA与2．3μM KIN，所有情况下，生长素是必需的，2，4-D可能足以诱导愈伤组织。一经产生，就能在MS+4．5μM 2，4-D上予以保持，无需CH，或将愈伤组织转移到另一培养基，例如B5+4．5μM 2，4-D。
除直接植株再生外，有可能或经愈伤组织媒介植株再生，或从细胞悬浮培养体再生植株。如果在加2，4-D培养基上启动和保持愈伤组织生长，要取得芽形成成功，必需用细胞分裂素代换2，4-D。这样，Gamborg等(1979)曾从烟草长期悬浮培养体取得植株再生。许多学者曾变动生长素与细胞分裂素的大量组合，企图取得烟草植株再生成功。
2．单倍体 Bajaj(1983)汇总了花药培养。经花药培养取得单倍体的烟草种见表27-8。Bourgin与Nitsch(1967)培养Nicotiana种花药取得了大量成熟单倍体植株。曾用染色体数和单元体花不育性证实了这种单倍体。单核小孢子期花药培养后一个月形成再生植株。单倍体胚表现正常胚胎发生过程：球形，心脏形和鱼雷期，其植株比正常二倍体较小，常产生许多花。人工培养下常见到非典型形态，但经移入钵内后新生长的变成表型正常。
表27-8 烟草属种花药培养
Sunderland与Wicks(1969)用普通烟草的不同发育时期花药培养，得出结论：用(a)8-16mm花瓣的单核花粉粒或小孢子，反应最快，然后(b)17-20mm花瓣的花粉粒第一次有丝分裂小孢子。并肯定后者是烟草形成再生植株的临界转变点。可惜，即使是血缘关系密切的种，培养的花药没有单一的最适小孢子发生时期。
Sunderland(1973，1974)描述了小孢子培养体的三种发育途径：途径A，发生于烟草，从营养细胞发育成胚，而生殖核在刚经过一或二次有丝分裂或其后立即退化。途径B，见于南洋金花，经不对称有丝分裂结果，形成二个相等、扩散、营养型核。能在花粉有丝分裂前的任何时期花药培养中发生。有些设想认为营养细胞能循着器官建成发育模式进行。途径C，不产生单倍体，其中生殖核与营养核在核分裂前融合。
曼陀罗和烟草属花药培养诱导胚胎发生直到球形期，只要在琼脂中加2%蔗糖，只有当在培养基中加无机盐类中时，能继续发育。Nitsch(1971)报道了铁是胚发育完全的关键因素。高等植物缺铁与精氨酸用量过高有联系，为将精氨酸加入烟草花药培养基中时，胚发育抑制所证实。
花药的诱导，有赖于植株年龄和生长环境。以开花开始时的花药反应比开花末期的为大，温室种植的季节间也有差异，短日比长日条件下的烟草花药更为相宜。
花药接种前预处理能增高诱导效果。低温冲击处理(3-5℃，48-72h)，烟草和曼陀罗每花药胚数增多。
若干事例中，单倍体曾应用于烟草育种。中国烟草，科学研究所用加倍单倍体育成了高产、优质新品种，并已推广大面积生产。
Brown与Warnsman(1982)报道加倍单倍体的农艺特性包括产量降低。Burk与Matzin-ger(1976)虽看到加倍单倍体某些农艺特性降低，但生物碱与还原糖都增高。烟草与林烟草都曾观察到加倍单倍体生长旺势减退。
曾用烟草F1杂种的加倍单倍体曾用于抗病育种。Nakamura等(1974)从日本黄色品种MCl610取得了对细菌枯萎病，黑秆病和黑根腐病抗性增强的三个加倍单倍体选系。其农艺与化学特性与亲本的相同。Chaplin(1978)评价了从VY32(马铃薯病毒Y抗性系，Rhod-esia)×Coker86(TMV，根腐线虫，黑秆、细菌枯萎和镰刀菌枯萎病抗性)产生的加倍单倍体。培育成一个品系，具有马铃薯病毒Y和黑秆病抗性和农艺特性好。Wark(1977)采用加倍单倍体，把兰霉的三个族系从颤毛烟草或高烟草和古特斯比氏烟草转移给黄色种烟草。此外，从加倍单倍体取得了农艺特性好和抗TMV和兰霉病的品系。
3．胚珠培养 烟草属大量种间单向或双向有性杂交不亲和。有些是由于机械致因，例如花粉管不能到达胚珠。但许多虽能受精，胚不能发育。可取受精胚珠离体培养(即最适生长条件)恢复败育胚的发育。实质上有些胚败育，是由于胚乳的发育反常而使胚发生饥饿，而不在于胚本身。
尽管胚或胚珠培养对取得新奇有性杂种有潜力，这种技术对烟草种杂交尚未应用。Du-lieu(1976)测定了离体培养烟草属胚发育的发芽的最适条件。在活体上受精前，花粉可收集和储存在5℃干燥器里。通常取受精后5-10天胚珠进行人工培养。胚珠的基础培养基是不加荷尔蒙的MS。附加的有机化合物对胚珠培养或是有毒的(例如CH，KIN，NAA，甘氨酸和天门冬酰胺)或是效果不好(例如谷酰胺)。维生B是胚发育所必需，培养基附加20%椰乳增强胚的生存。胚珠培养蔗糖浓度是关键。大多数培养基加蔗糖2-3%，4-8%蔗糖最适于胚发育。高于8%有抑制作用。Dulieu(1976)提出了烟草属胚珠培养最适体系：受精胚珠培养在加4-8%蔗糖上，直到胚大小达到400-500μm，然后把胚珠转移到渗透压较低培养基上，例如0．8%琼脂，2%蔗糖。这样能达50%发芽。
Reed与Collins(1978)用受精胚珠培养，产生了内索非拉烟草×烟草和斯托克通氏烟草×烟草杂种。受精胚珠拯救成功，有赖于人工培养前受精后的时间。与Dulieu工作相反，Reed与Collins(1978)把胚珠培养在低浓度蔗糖培养基上。只有用烟草属野生种作母本取得了杂种植珠。这些从胚珠拯救的杂种能抗黑秆病(野生种亲种的特性)，胚珠培养对烟草种有潜在效用。
4．原生质体分离与培养 Evans与Bravo(1983)评述了包括烟草属种在内的原生质体分离与培养方法。Evans(1983)和Gleba与Evans(1983)讨论了原生质体融合。至少已有17个种分离取得了原生质体(表27-9)。
表27-9 从原生质体能再生植株的烟草种
关于原生质体分离程序，条件(种间和种内)和原生质体培养的培养基和植物生长调节剂参看Evans与Bravo《植物细胞培养手册》第一卷第四章。
烟草原生质体分离，至少有4种细胞来源：叶肉、表皮、细胞悬浮培养体，和茎愈伤组织。成功技术的多样性，可见较易制备。
分离与培养烟草原生质体的可供选用的渗透性多样。大都采用非代谢性的糖D-甘露糖醇。已有报道观赏烟草种为0．23M，烟草高达0．7M(Nagata与Takebe，1971)。烟草属原生质体对渗透性可能不很敏感：烟草叶肉原生质体曾用0．4M高达0．7M(Nagata与Takebe，1971)甘露糖醇分离取得。最常用浓度为0．4-0．5M。葡萄糖浓度0．35-0．4M取得成功(例如Evans，1979)。
分离原生质体的酶也有不同。大都不用脱盐的酶，虽它对原生质体生长和继后植株再生有重要性。广泛采用Onozuka Rl0纤维素酶。常与macerozyme(macerase)配合施用。这对某些种(例如林烟草)是适用的。纤维素酶常用浓度为1．0-2．0%。需要较低浓度(常用约0．5%)macerase。Bourgin等(1979)用0．05%Driselase，但Passiatore与Sink(1980)则用1%。
全部情况下，原生质体在高强渗透性培养基中启动培养。烟草愈伤组织能在只有生长素的培养基上生长，而原生质体培养一般需要生长素和细胞分裂素。此外，培养基常需富含维生素、糖类、氨基酸、椰乳或其它有机化合物，这些是愈伤组织培养基不常用的(例如培养基8p)。原生质体分离后3-6周，愈伤组织生长良好，足以将细胞转入芽再生培养基。在附加高浓度细胞分裂素(5．0μM6BA)或高浓度细胞分裂素配合弱生长素，例如22．8μM IAA+11．9μM KIN培养基可形成芽。常把芽移至无荷尔蒙培养生根。
分离的原生质体能诱导融合，产生杂种细胞。表27-10列出烟草种间体细胞杂种。Evans(1983)叙述了PEG诱导烟草原生质体融合法。原生质体融合技术虽简便，鉴定杂种细胞系或植株是困难的。根据一或更多特征选择杂种。第一个体细胞杂种是以亲本与杂种细胞的不同营养要求选得的。烟草种的某些有性杂种，例如粉蓝烟草×蓝格斯多夫烟草，产生遗传性肿瘤。这些肿瘤细胞培养体的生长是生长素自养的，而亲本细胞培养体的生长则需要生长素。Carlson等(1972)在粉蓝烟草和蓝格斯多夫烟草叶肉原生质体融合后，在细胞培养体中选择生长素自养体。由此再生植株是体细胞杂种。由于只有极少数烟草属种间杂种产生肿瘤，这种选择方案受到了局限。
表27-10 烟草属体细胞杂种
白化细胞系曾广泛地应用于选择烟草体细胞杂种。烟草半显性硫突变体(Su)已证明适用于选择烟草与其它烟草种间体细胞杂种。Su／Su是白化，Su／Su淡绿色，Su／Su野生型深绿色。烟草Su／Su细胞悬浮培养体分离的原生质体，与烟草，林烟草，N．otophora粉蓝烟草，内索非拉烟草和斯托克通氏烟草的叶肉原生质体融合后取得再生杂种植株。全部杂种淡绿色，用几种特性证明其杂种性，包括染色体数，植株形态和同功酶分析。此外，曾用二种白化性的互补产生淡绿色杂种植株，以鉴别杂种。这样，二个亲本受白化系的局限，而采用半显性标志如Su，则任何种能用作第二亲本。
采用生化标志(如离体培养分离的突变体)于原生质体融合，烟草尚未充分开发。生化标志为核或细胞质基因组所编码。因此，无论是核杂种即体细胞杂种或胞质杂种的选择，都能采用。都具有显性核突变的二个细胞系间杂种，例如抗代谢物抗性，将能抗二种选择的化合物，而不是这一种或那一种亲本细胞系的抗性。例如，White与Vasil(1979)将林烟草抗氨基酸衍生物5-甲基色氨酸和S-氨乙基半胱氨酸的二种细胞系分离的原生质体融合，取得了具有二种抗性的杂种细胞。另一方法，可用二种营养缺陷突变体的互补作用以分离杂种细胞。Geimelius等(1978)从硝酸还原酶缺陷体cnx细胞系与另一硝酸还原酶缺陷体nia细胞系分离原生质体融合。虽然无一亲本细胞系能利用硝酸盐，或再生芽，杂种细胞系能加以利用，并再生芽。Flick(1983)就硝酸还原酶突变体进行详细讨论。
采用选择的细胞质标志，例如抗生素抗性，能选择细胞质杂种细胞系。Medgyesy等(1980)选择了从烟草叶绿体转给林烟草。用醋酸碘钝化烟草链霉素抗性细胞系核(SR-1)。用PEG使这种处理过的原生质体与未处理林烟草原生质体融合。选得了链霉素抗性愈伤组织。由于烟草原生质体不能增殖，只有细胞质杂种是有链霉素抗性的。由此，通过采用在人工培养体细胞杂种中分离的突变体，融合后易于选出细胞质杂种。
原生质体分离、培养和融合技术，应用烟草改良，曾讨论了原生质体产生的植株的一些农艺特性。Evans(1981)曾测验过体细胞杂种的潜在农业价值。内索非拉烟草十烟草体细胞杂种，像野生种亲本一样，具有烟草嵌镶病毒抗性。这种体细胞杂种与相应的有性杂种(用胚珠拯救技术取得)相比较，指出体细胞杂种克隆的变异性比有性杂种要大得很多。可见原生质体技术，可能有益于烟草改良。
5．突变体分离 Flick(1982)评述了人工培养下烟草突变体分离的现代文献和技术(表27-11)。Flick(1983)详细讨论分离突变体技术。从蓝茉莉叶烟草+林烟草和烟草分离出36不同表型共43突变体。32／43从烟草产生的。多数突变体是显性或半显性。Carlson(1970)从单倍体烟草分离出隐性营养缺陷突变体。由于烟草是异源四倍体，它们是漏网者。蓝茉莉叶烟草和林烟草是二倍体种。林烟草分离出的突变体都是二倍体，蓝茉莉叶烟草营养缺陷体是从单倍体植株叶肉原生质体取得的。
看表27-11十分明显多数烟草突变体是用正选择分离的，即选择代谢物抗性。曾用许多毒性化合物，包括氨基酸衍生物，核酸碱基衍生物，一种灭菌剂，抗生素和除莠剂。Carlson(1970)用溴脱氧尿苷补给烟草的营养缺陷体。大规模筛选个别细胞克隆的营养要求，分离出蓝茉莉花烟草的其它营养缺陷体。
表27-11 人工培养下分离出的Nicotiana的突变体
Flick(1983)人工培养下分离的许多烟草突变体再生了植株，但很少进行遗传分析。Chaleff与Porsons(1978)指出烟草的Picloram抗性是一种显性核等位基因。另一方面，Carlson(1970)分离出的烟草营养缺陷型是隐性。Maliga(1981)分离出隐性核链霉素突变体。大都链霉素突变体是细胞质遗传的。至少一种链霉素抗性突变体(SRI)是由于改变了叶绿体核糖体蛋白质。当在人工培养下选择突变体，有可能产生显性、隐性和细胞质突变。
43烟草突变体中，极少数直接应用于农业。林烟草和烟草分离出耐盐细胞系。烟草耐盐性经有性传递，但频率低。林烟草耐盐细胞系未能再生植株。虽已取得林烟草耐低温系，但不能有性传递。某些除莠剂的毒性，曾用于人工培养筛选。从烟草细胞培养体再生植株，能抗Bentazone，Paraquat，Phenmodifarm和picloram。Bentazone与Phenmedifarm抗性是核隐性实变，而picloram抗性是显性核突变。这些烟草突变核中，有些可用作原生质融合试验的选择标志。上述讨论，人工培养下分离的突变体，曾用于选择杂种细胞系。
(三)培养程序
1．用叶外植体离体培养繁殖烟草属
(1)从幼年开花前植株选取叶。
(2)叶表面消毒。温室生长植株，用8%商品漂白粉(0．42%次氯酸钠)6min已可。乙醇敏感Nicotiana种应避免用乙醇消毒。用无菌蒸馏水洗经漂白粉溶液消毒的用，3次。全部消毒过程，可在100mm培养皿内进行。
(3)避开叶脉，把叶切成1cm2小段。叶外植体无菌接种在固体再生培养基上。多数加5uM BA。
(4)经3-5周芽的增殖。取芽，放在附加110μM3-氨基吡啶MS上生根，不加生长调节剂。
(5)生根的芽，可移植土中。
2．烟草属的花药培养
(1)仅用植株的第一朵花。这些花芽将具有同步的小孢子，将能产生较好结果。
(2)芽用8%商品漂白粉表面消毒6min，如叶外植体所述。
(3)用无菌蒸馏水洗芽后，无菌从芽切取花药，接种在培养基上。应除去花丝，不要伤花药壁，否则会增殖。烟草属花药常培养在Nitsch H培养基(即MS的
浓度，但Fe·EDTA保持正常水平)上。不加生长调节剂。
(4)3-4周内，花药裂开，出现再生植株，后者可转移到无生长调节剂的MS，加1．5μM BA。但应注意BA会引起许多种烟草的染色体加倍，例如林烟草。
(5)植株移入土中，放置温室继续生长。取根尖观察细胞染色体数，以判定其单倍体性。
(6)增高雄核发生频率的步骤：(a)低温处理切取的芽，48小时，4℃。和(b)培养基加活性炭。
3．烟草属种间杂种的胚拯救
(1)未开的花人工去雄，用早一天收集的供体花粉授粉。用纸麦管罩着柱头和花柱，防止异花受精。
(2)受精后间隔不同期间取蒴果，供离体培养用。每个种组合的最适间隔期经测验决定。
(3)蒴果表面消毒程序：70%乙醇中2．5min，20%商品漂白粉5 min(1%次氯酸钠)，无菌水淋洗2次。
(4)无菌下用解剖刀与摄子除去子房壁。把受精胚珠移至Nitsch N培养基。
(5)将发芽中幼苗移至半浓度Nitsch培养基。
(6)如果植株失绿或其它不健全，切成小块，接种在LS培养基加9．3μM KIN和5．7μMIAA上诱导愈伤组织。
(7)从愈伤组织再生的芽，移至半浓度NitschN生根。生根后，植株移植土中。
(四)展望
烟草属为运用人工培养技术于作物改良提供更大的希望，与其它作物相比。大多数其它作物只能采用有限的人工培养技术，烟草突出地成为组织培养的典范体系。曾做过许多基础研究。
有可能应用人工培养常规繁殖烟草。依据需要目标，可克隆繁殖植株，或用人工培养法增加一个品种内遗传变异性。克隆繁殖有利于保存雄性不育，种子生产量低的品种或杂交品种。这样，从有限量的外植体开始，常规产生许多植株。克隆繁殖常以茎尖培养效果最好。非分生组织的组织再生植株，可增高供试品种的遗传变异性。Bravo与Evans从叶外植体再生的N．alata Nicki杂种群体中，观察到其变异性比种子群体为高。其中有许多园艺特性，能产生品种改良效果。
烟草是有性繁殖种，新品种或选系必需育纯后即同质性才有价值。常规同质系是用反复自交取得。要经多年完成。采用花药培养可完成许多有性世代，花药培养产生单倍体有许多潜在价值：(a)加倍单倍体取得同质二倍体，由此超越了多年有性繁殖。(b)单倍体植株或细胞培养体分离的原生质体的融合，将能产生染色体数与有性杂种相同的杂种。如果原生质体融合用于细胞质特性(例如品种间雄性不育)或不需要增多染色体数，这可能是重要的。(c)隐性突变体只能从单倍体培养分离取得。凡此都能作为已有基础技术立即应用于烟草。
烟草野生种代表着遗传信息巨大储存库，能潜在地渗入烟草。可是，许多野生种与烟草有性不亲和。如果是受精后发生的，可用胚珠培养，以取得新奇有性杂种。Reed与Collins(1979)采用内索非拉烟草×烟草和斯托克通氏烟草×烟草的受精后胚珠培养取得有性杂种，证实了这种现象。它们渗入了野生种的黑秆病抗性，有其农业价值。可是，胚珠培养的应用，有几种限制因子：(1)需要经过受精，如果存在有性不亲和性，胚珠培养无用。(2)尽管采用受精胚珠人工培养，仍有可能二个亲本种只是单向有性亲和。如通过胚珠培养取得的内索非拉烟草和斯托克通氏烟草×烟草杂种，确是这样。只有用烟草野生种作为母本，胚发育才能成功。
原生质体在作物改良中有许多潜在应用价值。上述受精后胚珠培养取得杂种技术，不适用于原生质体融合，由于是用体细胞融合的。原生质体融合可能产生全部可能的核-细胞质组合。采用适当选择的标志，可完成细胞质转移而无核杂交。因此，有可能产生大量新奇杂种。二个种的有性杂种有一致性，相应的体细胞杂种具有许多遗传变异性。如Evans等(1982)内索非拉烟草+烟草体细胞杂种与相应有性杂种的比较。原生质体融合引进着一个大的遗传信息储存库，用于潜在作物改良。
当从非分生组织的组织再生植株时，证实了出现遗传变异性，从原生质体再生植株时，也应如此。与叶外植体再生植株相反，原生质体产生的植株，来源于单细胞，由此每植株应是遗传上一致的。Shapard与Totten(1977)证实了从马铃薯原生质体再生植株中，存在着广泛变异性。
从细胞培养体直接选择突变体，为选择特种性状提供机会。例如除莠剂抗性，耐寒性或耐盐性。除莠剂抗性突变体，使得可在作物上施用正常致死浓度的除莠剂。马铃薯和玉米证实了植物毒物抗性，但烟草尚未找到。Carlson(1973)指出从离体培养分离出的sulfoximine抗性突变体再生植株能抗野火病与全部基因组组合的有性杂种或体细胞杂种相反，突变体分离能以分离出一个品系，只具有单一的需要的遗传性改变。由此不需要消除不合需要的外来种质。
十分清楚，人工培养技术能立刻用于烟草育种。有可能运用上述诸技术之一，把新遗传信息掺入烟草。无论抗病性、生物碱含量或其它有育种价值的农艺特性都可应用。组织培养技术当与常规育种方案相结合才能在烟草改良中取得成功。
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