DNA杂交技术的原理及探针种类
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第115页（4482字）
DNA是由腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶及胸腺嘧啶四种碱基组成，所有DNA中腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)的克分子含量相等，两条核苷酸链依靠彼此碱基之间形成的氢链相联系而结合在一起，一条链上的嘌呤碱必与另一条链上的嘧啶碱相匹配，按A=T、G=C、碱基互补原则形成双链DNA。因此，当一条核苷酸链的碱基序列确定后，即可推知另一条互补链的碱基序列，这就是DNA探针杂交技术的基础。
1．DNA探针杂交技术 DNA杂交技术是根据两条单链DNA(或DNA与RNA)中互补碱基序列能专一配对的原理进行的，在一定条件下，双链DNA变性成单链，单链DNA或RNA能与另一条单链DNA上互补的碱基形成氢链，从而使两条单链杂交成双链DNA分子，通常利用已标记的某一DNA片断作为探针，检测被检物中是否有与探针同源的DNA序列。DNA探针着眼于微生物的基因组成和结构，物种都具有特定的核苷酸序列，并以此区别于其他物种，因而微生物的基因组成结构就是其本质属性，利用这一属性的差别，就可识别和鉴定它们。
根据DNA的来源和片断不同，目前使用较多的有以下2类。
(1)全染色体DNA探针：这类探针制备简便，不需要重组克隆片断的初筛工具，也可作为临床检测某些病原体的方法，但其特异性不如克隆片断探针。
(2)克隆片断DNA探针：这是目前使用最多的探针类型，由于克隆片断的特异性可以选择，因而它具有更大的灵活性，而且便于进一步分析DNA结构及发展新的检测技术，如PCR技术。因此，自Mosely(1980)首先报道利用大肠埃希氏菌编码肠毒素的基因特异性片断探针检测产毒性大肠杆菌(ETEC)以来，这类探针已运用于沙门氏菌、绿脓杆菌、志贺氏菌、伤寒沙门氏菌、结核杆菌、耶尔森氏菌、淋病球菌等病原菌的检测，近年的研究表明，DNA探针杂交检测具有较高的特异性和敏感性，尤其适用于培养困难、致病性强、生长缓慢的病原菌的检测。但事实上目前DNA探针检测病源菌在临床上并没有广泛应用，其主要原因在于：①样本抽提DNA复杂；②探针的放射性同位素标记；③敏感性还不够高。因此要提高DNA探针的实用价值，就必须改进杂交技术，简化操作步骤，发展非同位素标记探针方法，开发新的分子生物学技术以提高敏感性。
2．非同位素标记DNA探针的进展 非同位素核酸探针制备这类探针不需要放射性同位素，而是在核酸链上共价连接半抗原、生物素或荧光素等化学基因，核酸分子杂交后，通过酶底物显色或荧光计检测，这类探针对人体无放射性危害，对环境无放射性污染，探针可较长时间保存，检测程序简单，有些探针的灵敏度已达到或接近放射性同位素标记的探针，有可能取代同位素核酸探针而广泛应用。
按照连接核酸链上示踪物的不同，以及检测系统的不同，分为以下四种类型的探针。
(1)生物素核酸探针：这是最早使用的非同位素标记法，它利用生物素(biotin)易结合亲和素(avidin)，迅速形成稳定的复合物的特性，将生物素引入待标记的核酸链上，DNA杂交反应后，加入亲和素－酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶)，通过酶底物显色反应了解核酸探针与靶核酸的杂交情况，这种由核酸－生物素－亲和素－酶－底物组成的核酸检测系统，即为生物素核酸探针检测系统，现在它已广泛用于核酸杂交的研究中，检测灵敏度可达几十Pg，较放射性同位素差，且有一定非特异性本底显色，但它易于保存，操作简便，国内已有生物素化dUTP及探针标记药盒出售。
(2)免疫核酸探针：用半抗原修饰标记的核酸，制成具有免疫原性的核酸探针，探针与靶核酸序列杂交后，用抗原抗体的免疫反应来检测，这类探针选择的半抗原有荧光素衍生物AAF或AAIF与鸟嘌呤的共价结合物，FITC异构体和聚乙烯亚胺(PEI)的连接体，再与FITC交联引入DNA探针，磺基根共价连接在胞嘧啶的第六位碳原子上引入DNA探针等。
地高辛配基标记DNA探针是80年代末90年代初发展起来的一种免疫核酸探针，通过随机引物法将地高辛配基－11－dUTP引入待标记核酸，制成探针，与靶DNA杂交后，加入抗地高辛抗体－碱性磷酸酶复合物，使酶底物NBT和BCIP反应而显色，该标记探针的灵敏度，可检测小于0．1PgDNA，达到放射性同位素标记检测系统的水平，超过生物素标记探针检测系统，而且其杂交背景清晰，结果易于判断，是公认较好的非同位素标记方法，目前这一标记法已用于微生物病原体的研究之中，国外已有成套药盒出售。
(3)化学方法连接的核酸探针：将碱性磷酸酶或过氧化物酶连接聚乙烯亚胺(PEI)，共价连接在DNA上，杂交反应后，加入酶底物发生化学反应而显色。
(4)荧光物质标记的核酸探针及化学发光物质标记DNA探针。
3．多聚酶链反应(PCR)技术的应用 DNA探针虽然具有较高的灵敏度，但在某些微量标本的检测中，通常不得不依赖待检细胞，微生物的培养扩增后才能检出，而利用多聚酶链反应，以某一DNA链上的特定片段为模板(引物)合成互补序列，经过几十个循环后，靶DNA数量可扩大100万倍。多聚酶链反应的一个特定循环包括以下三个基本步骤：①模板DNA变性；②在模板DNA序列的3’端和5’端分别连上两个合成的寡核苷酸引物；③在热稳定性DNA聚合酶的作用下，以靶DNA模板的引物延伸。这一高效率的体外基因扩增技术一经问世，立即引起广泛的注意，其灵敏度可以检出1个拷贝的病毒DNA，这一检测技术的关键在于已知模板DNA的序列，根据这个序列合成寡核甘酸引物。
4．DNA探针在类杆菌及其他厌氧菌的检测 由于类杆菌细菌是临床上最多的一类条件致病菌，其分离培养鉴定困难费时，所以国外进行了一系列DNA探针的研究。Salyers等将多形类杆菌DNA用HindⅢ消化酶切得到的片段DNA插入32PBR323质粒，引入大肠杆菌E．Colik12工程菌，随机克隆，然后用32P-dCTP标记重组质粒，与多形类杆菌、卵形类杆菌、单形类杆菌、脆弱类杆菌、吉氏类杆菌和埃氏类杆菌等进行杂交筛选，5个克隆片断中有两个与多形类杆菌杂交，经用65株细菌进一步进行特异性鉴定，其中的PBT2(2．28kb)可作为多形类杆菌的特异性探针，对多形类杆菌株杂交率为65%～146%，而其他细菌与PBT2探针杂交率不超过10%。Bradury等对脆弱类杆菌、卵形类杆菌、普通类杆菌及3452A(即粪类杆菌B．caccae)的染色体DNA用限制性内切酶(EcoRl)酶切图谱分析，显示DNA同源性在15%～85%的菌种之间酶切图谱都有差异，即使是同种不同株的卵形类杆株菌0038和3524，酶切图谱显示明显的差异，同时用单形类杆菌，卵形类杆菌及脆弱类杆菌EcoR1酶切片断制备32P标记探针，和类杆菌属细菌染色体DNA的酶切片断做Southern杂交，结果显示用限制性内切酶图谱分析加Southern杂交对于鉴定DNA同源性小于24%的细菌更有利。Kuritza等将普通类杆菌染色体DNA的酶切片断进行重组克隆，从中选出PBV－1(700bg)作为探针，该探针与普通类杆菌DNA特异杂交，而不与其他类杆菌DNA杂交，这个探针可检测纯培养物，混合培养物和人粪便中的普通类杆菌，其优点是不需要从混合标本如粪便中分离菌落，不需要生化试验鉴定厌氧菌，敏感性为107／ml菌体，标本需抽提DNA后点样做斑点杂交。然后Kuritza又对类杆菌属不同菌种的染色体DNA进行了HindⅢ酶切消化，重组克隆，用32P经缺口转移标记重组质粒探针，与类杆菌不同菌种、梭杆菌属种和其他某些阴性细菌染色体DNA进行杂交，筛选不同特异性的探针，结果有三个探针PBF11－4，PBF11－5，PBF11－61与脆弱类杆菌DNA特异性杂交，有一个探针(PBE－3)和脆弱类杆菌群所有细菌杂交，还有一个探针(PBO－21)和所有类杆菌属细菌以及坏死梭杆菌和具核梭杆菌杂交。利用和单形类杆菌染色体DNA特异性杂交的PBU－2重组质粒，对普通类杆菌染色体DNA特异性杂交的PBO－4质粒，针对B．caccae的PB3－4重组质粒，以及针对多形类杆菌的PBT－2等四个重组质粒32P标记探针，对经碱裂解抽提DNA点样的粪便标本进行斑点杂交，探针的敏感性在107～108CFU菌量即1×109细胞／干粪便。Martin等认为，用DNA探针检测和鉴定细菌与常规细菌学方法比较，特别是对培养和鉴定较困难的厌氧菌，革兰氏阴性厌氧菌占绝对优势，菌种很多，它们的表面特征又非常相似，要做很多不同的生化试验才能鉴定到种，并且一些细菌虽经生化试验仍不能鉴定，而利用不同特异性的DNA探针，可以很方便地进行厌氧菌的鉴定。第二，在某些条件下，可以直接检测标本中的厌氧菌，或在培养基中经增菌后，再从标本中检出厌氧菌，可以快速简便地诊断，而且冷冻标本亦可进行探针杂交检测，但同时提出标本中的待检细菌含量太低，少于106／ml。探针检测可能会出现假阴性结果，笔者还注意到放射性同位素标记探针在应用中的局限性，曾尝试用生物素标记探针检测，因非特异性背景显色而失败。国内华西医大汪冰等首次用非同位素标记脆弱类杆菌DNA，用于检测厌氧菌获得成功，地高辛配基标记探针检测灵敏度为10gDNA和104cell，接近32P标记探针的灵敏度，与同位素标记探针比较，它具有简便、快速、无放射性污染的优点，值得推广。
克隆片断DNA探针由于检测的基因拷贝较少，故敏感性较低，Roberts(1987)利用不解糖卟啉单孢菌、罗斯普氏菌、中间普氏菌的全染色体DNA，用32P标记制备探针对236株临床分离菌株进行杂交，用放射性液闪计数杂交率鉴定不同种的细菌。结果显示：不解糖及牙龈卟啉单孢菌的鉴定率为100%，中间普氏菌为96%，产黑普氏菌为95%，7株生化试验不能鉴定的菌株利用不同的染色DNA探针可以鉴定。DNA杂交检测只需36小时，而生化试验鉴定需7～21天。笔者提出：用DNA探针能更准确地鉴定细菌，因为细小的基因结构改变可能导致生化试验结果的差异，而全染色体DNA探针杂交结果相对稳定，和克隆片断DNA探针相比较，更敏感，可检出104细菌，而且不需要重组克隆。