方法
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第112页（2391字）
1．模板与扩增
(1)模板从厌氧菌的标准株制备纯化的DNA，用DNAse(DNA酶)切下特异性片段(一般以104拷贝的待扩增片段)做起始材料(10ng量即可)又称为“模板”，模板中不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶的抑制物，以及结合DNA的蛋白。
(2)引物，进行PCR扩增技术，引物是PCR结合的关键。引物的长度以15～30个碱基为宜，(G+C)含量约50%，尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，避免引物内部形成二级结构；必要时，尤其在引物末端，避免形成引物二聚体。人工合成的寡聚核苷酸引物最好经过PAGE或离子交换HPLC进行纯化。引物浓度宜偏低，避免非特异性产物产生。
(3)Mg2+浓度，其对反应产物的特异性及产量有显着影响，浓度过高，使反应特异性降低；浓度过低，使产物产量减少。在各种单核苷酸浓度为200mmol／L时，Mg2+为1．5mmol／L为宜，样品中含EDTA或其他螯合物，或高浓度DNA时，必须相应调节Mg2+的浓度。
(4)dNTP浓度常用50～200mmol／L的dNTP，不能低于10～15mmol／L，四种脱氧三磷单核苷酸的浓度应相同，否则易于诱发聚合酶的错误掺入，或降低合成速度，或过早中止延伸反应。
(5)TaqDNA聚合酶的用量，在100μl反应液中，一般加入2．5u的酶量，足以达到每分钟延伸1000～4000个核苷酸的掺入速度。酶过量易导致产生非特异性产物。
(6)循环参数PCR程序是把起始材料加热到90～95℃，保持短时间使双链DNA(dsDNA)解链，然后冷却至37～55℃，使引物同模板上与其互补的序列退火，并升温至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下掺入单核苷酸，使引物沿模板延伸。引物与模板退火温度由引物的长度和GC含量决定，一般先用37℃的反应条件。若电泳检测时发现有非所需产物，需增加退火温度，退火时间1～2分钟即可。引物延伸在70～75℃，保温时间根据扩增片段长短来调节，正常情况下，每分钟可延伸1kp的长度；如果扩增片段150kb左右，则免去此步。总之，将待扩增的厌氧DNA于90～95℃下解链成单链模板。人工合成的两个寡聚核苷酸引物，在37～55℃中分别与目的片段两侧的两条链互补结合，加入2．5uTaqDNA聚合酶并调节Mg2+浓度，DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物3’端开始渗入，沿模板5’→3’方向延伸，合成DNA新股，每周期产生DNA均能成为下一次循环的模板，常规PCR一般为25～40个周期即可(如一周期94℃，1分钟；50℃，2分钟；72℃，3分钟)。取20ml反应液在1．5%低溶点琼脂糖凝胶中电泳分离，将含所需片段(如＜400bp)的胶片切下，加入4倍于胶体积的灭菌去离子水，65℃加热10分钟，使凝胶溶解，又可行第二次PCR扩增。然后将扩大增液纯化、浓缩。最后取适量溶解液直接行序列分析，或用特异探针行斑点杂交等检测。
2．探针制备 探针制备[切迹取代法( niek translation)]，先以微量DNAse将DNA形成切迹(缺口)，DNA多聚酶将4个脱氧核苷(dATP、dCTP、dGTP、 dTTP)其中一个以上是高比活度的同位素标记(a－32P、dNTP或[3H]dHTb)来修复切迹，使同位素掺入DNA，经Sephadex过柱，收集标记DNA组份，即为探针。
3．生物学标记的探针 以生物素(biotin)取代同位素标记探针，即以Bio-dUTP按切迹取代法掺入DNA，制备成生物素探针，杂交后检查生物素探针的两种方法：一是待检标本DNA－生物素探针－羊抗生物素Ig－荧光素标记的兔抗羊的抗体，显示荧光素的标本为杂交(+)。生物素探针有效使用期长，4℃可保存1年，显色反应快速，只需几分钟至数小时，但目前敏感性不及32P探针(至少差10倍以上)。
总之，探针的特异性取决于DNA的纯度和序列的特异性。如人巨细胞(HCMV)的核酸有几个区段和人细胞核酸的序列一致，如用HCMV全系列制作探针，便可与人细胞核酸发生杂交反应。所以应选择与宿主细胞核酸无交叉，与其他厌氧菌DNA的核酸序列也无交叉的片段来制备探针，提高探针的特异性。
4．杂交方法(此处只作简述)
(1)班点杂交法：将待检标本(血清病原或其提取物或细菌菌落)点在变性探针杂交、洗膜、自显影。详情在上一节液相变性速率法已做介绍，据杂交率以判断厌氧菌的属和种。
(2)电泳带转移杂交：将组织标本中的DNA(含宿主及病原体的)提取，经凝胶电泳，将电泳带原转移到硝酸纤维滤膜上，变性、固定，同上予杂交，杂交后自显影(上一节固相杂交法中已详细介绍)。根据同源性的百分率，以确定检厌氧菌的属、群或种。
(3)原位杂交：组织切片或细胞涂片、染色体标本，固定在玻片上变性杂交，浸显影剂(核4乳胶)自显影，再用普通染色显示组织细胞，镜下可见杂交显影是在组织细胞或染色体上的位置，判断病原体是在细胞外或胞浆或核内，以判断厌氧菌感染部位和致病厌氧菌的种属。