方法
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第128页（1761字）
(一)试剂的配制
1．包被缓冲液 Na2CO31．59g，NaHCO32．93g，NaN30．2g，加蒸馏水定溶至100ml，pH9．6，保存4℃，2周内用毕。
2．磷酸盐－吐温缓冲液 NaCl18g，KH2PO40．2g，NaHPO4·12H2O2．9g，KCi0．2g，Tween－200．5ml，NaN30．2g，加蒸馏水至1000ml，pH7．4，保存4℃冰箱。
3．酶结合物 于低温条件下保存备用。
4．底物 用于赖根过氧化物酶结合物(HRP)的底物有
两种：
(1)邻苯二胺(OPD)溶液：取磷酸盐－柠檬酸缓冲液100ml，加OPD40ml，3%H2O20．15ml，用2MH2SO4中止反应。此底物为橙黄色，吸收光谱在495nm。
(2)5－氨基水杨酸：取5－氨基水杨酸8mg溶于10ml热蒸馏水中，冷却后置4℃冰箱保存。于用前将此溶液加热至室温，以1NNaOH溶液调整pH值为6．0，取1ml0．05%H2O2与10ml氨基水杨酸溶液混合即可应用。此溶液为棕色，吸收光谱为449nm。
5．用于碱性磷酸酶结合物的底物 主要有对硝基苯磷酸盐。称取5mg对硝基苯磷酸盐，加入5ml10%二乙醇胺缓冲液(二乙醇胺97ml，先加蒸馏水800ml，加入NaN30．2，MgCl2·6H2O0．1mg，再加蒸馏水至1000ml，调pH9．8)，溶解后即可使用。以3MNaOH作为反应中止溶液，其水解产物为黄色，光吸收峰在405nm处。
(二)操作程序
1．间接法测抗体
(1)取聚苯乙烯微量反应板，于每孔中加入200μl抗原液(0．1MpH9．6的碳酸钠缓冲液适当稀释)置湿盒内，37℃作用3小时或室温过夜，取出或倾去抗原液，将磷酸缓冲液－吐温20洗涤液加入各孔中，3分钟后倾去，如此反复3次。
(2)于上述反应板每孔中，加入经磷酸缓冲液－吐温20适当稀释的待检血清和参考血清200ml，置湿盒中，于室温条件下作用2小时，反复洗涤3次。再于每孔中加入适当稀释的酶标记抗IgG200μl，置湿盒中，于室温下作用3小时，反复洗涤3次。
(3)于每孔中加入底物溶液200μl，置湿盒中，于室温下作用10～20分钟，每孔加入50μl中止剂，停止反应，用分光光度计测定。
2．双抗体夹心法
(1)于聚乙烯或聚苯乙烯微量反应板的各孔中，加入200μl含5～10ng／ml特异性免疫球蛋白，于37℃孵育5小时，反复洗涤3次(5～10ng／ml。加入200μl经磷酸缓冲液－吐温20适当稀释的待检血清及参考血清，置4℃过夜，洗涤3次。
(2)加入适当稀释的酶标记的特异性抗体(5～10ng／ml)200μl，于37℃条件下作用3小时，洗涤3次后加底物溶液200μl，于室温下作用10～20分钟，每孔加入50μl中止剂，停止反应，用分光光度计测定或肉眼观察。
3．酶标记抗原竞争法测定抗原 将特异性抗体适当稀释，吸附于载体表面，于4C作用过夜，取出洗涤3次。再加入经磷酸缓冲液－吐温20作不同稀释的待检抗原，酶标记的已知抗原，于室温下作用3小时，洗涤3次后加底物溶液200μl，于室温下作用10～20分钟，每孔加入50μl中止剂，停止反应，用分光光度计测定或肉眼观察。