麻风菌素试验

出处:按学科分类—医药、卫生 科学普及出版社《麻风病实验室工作手册》第164页(3975字)

麻风菌素是一种由含ML组织或提纯的ML制备的皮肤试验制剂,在一定程度上可以估计机体对ML的抵抗力。由于其它分枝杆菌的感染会影响人体对麻风菌素的反应性,因此麻风菌素试验无助于麻风病的诊断,也不能表明已往或目前麻风感染的情况,但可用以对已确诊的麻风病人作免疫学评价,有助于麻风病的分类和估计患者的预后。

一、麻风菌素的种类和制备方法

麻风菌素的种类和制作方法不一,且由于标本来源不同,在小批量制造中,激发反应的特异性程度和强度会有明显不同,因此制备方法应力求标准化。

(一)完整麻风菌素(integral lepromin)

即光田氏(Mitsuda)麻风菌素或粗制麻风菌素。这是过去及目前使用最广的一种菌素。通常所说的麻风菌素,主要是指这种菌素。用含菌多的人麻风瘤制成,因此除含ML外,尚有一定量的组织残渣。这种菌素制作方便,缺点是不同批的菌素所含组织量及细菌数有时相差悬殊,细菌结集分布不匀,因此试验结果也不标准。目前标准化的原则是尽量清除组织成份,并确定含菌量的范围。由于麻风瘤来源缺乏,也可用含菌多的其它组织,如用含菌多的淋巴结、肝、脾等制备的。自从用ML接种的犰狳实验感染模型成功以来,世界卫生组织支持成立含ML的犰狳组织库,作为供应ML的来源,并用犰狳ML制作麻风菌素取得成功,国际上已较大量地供应这种菌素,称为犰狳麻风菌素(lepromin A);而用人麻风组织制备的称为人麻风菌素(lepromin H)。

过去所述纯麻风菌素,它取的仍然是完整菌,只是用酶等处理反复离心,将ML与组织残渣尽量分离,因此所含组织很少,实际上还是属于完整麻风菌素的范畴。目前完整麻风菌素就是朝着纯麻风菌素的方向努力。因此粗制麻风菌素和纯麻风菌素的名称已无独立存在的必要。值得注意的是纯ML的提取应以不破坏ML的完整性为度。

制备方法:消毒后从重度感染的LL-BL型病人切取皮肤标本或从重度感染人ML的犰狳取组织。高压灭菌,120℃,15分钟。然后储存于-20℃冰箱中,制备前应先取少部分标本并用显微镜检查AFB的密度,证实有大量AFB才可用于制备;取小量标本做一般细菌培养,培养阴性方为合格。然后才在无菌条件下制备,全部过程应在一个工作日内完成。

将高压灭菌后的标本除去表皮和脂肪组织后,称重,用无菌剪刀剪成小块,加少量无致热源的生理盐水,在无菌条件下,用组织匀浆器制成匀浆,再加适量生理盐水,200×G离心10分钟,保留上清液,沉渣再混悬,重复离心,保留上清液。

两次离心获得的上清液,经尼纱布过滤,测定每毫升液体中的AFB数,并按规定所需细菌浓度(每毫升中使含4×107~1.6×108条)用无热源的生理盐水稀释,稀释液中加分析纯石碳酸,使稀释液中最终石碳酸浓度为0.5%。然后将此稀释液分装于适当容器内,高压灭菌,120℃15分钟,这样制备的菌素有高度的可重复性。

上述制备的麻风菌素还应经以下测定后才能应用。

1.每批量应做无菌测试 一般细菌培养阴性;

2.每批量做无害性试验 对5只小和两只豚鼠腹腔内分别注射0.2毫升和0.5毫升菌素。在注射后7天的观察期中,小动物必须仍保持健康;

3.每批量应做皮肤反应试验 两只豚鼠各皮内注射0.1毫升菌素。如注射部位不发生坏死则为合格;

4.测定每批中的总蛋白含量,其含量不应太高;

5.用化学分析法测定每批中石碳酸的含量,其含量不应超过0.55%

6.应用标准程序测定死麻风菌的数目,其菌数应在规定范围内。

麻风菌素应储于4℃冰箱内,可保存5年左右。如在低压干冻下保存,则效力和菌数可维持5年以上。

(二)ML可溶性抗原

目前较常提到的有两种:

1.Rees抗原 是从犰狳体内增殖的人ML制备的。菌体经超声粉碎,高速离心,除去沉淀的菌型,上清液用0.22微米的微孔膜过滤,测定蛋白浓度,用生理盐水稀释至10微克/毫升,使每一注射剂量含有1微克蛋白;

2.Convit抗原 也是用犰狳体内增殖的人ML制备,菌提纯后加压粉碎过滤,分离出低分子量部分。高压灭菌,并标准化,使每一注射剂量含蛋白5~10微克。

上述一类的可溶性蛋白抗原,曾称之为纯蛋白麻风菌素(leprolin)。

二、麻风菌素的使用

可用1毫升注射器(卡介苗注射器),25号针头。针筒和针头应脱开刷洗,高压灭菌。如用煮沸消毒,应用蒸馏水或去矿物质的水,煮沸至少10分钟。另准备一条有毫米刻度的透明小尺。

麻风菌素应注射于前臂曲侧。如要同时做两种不同的皮试,则应注射于两侧前臂。为避免读数时出现偏性,不同试剂注射的部倍(左、右臂)可不作预定,随机进行,但应正确记录。如所用为完整麻风菌素,抽用前应用力振摇容器,使悬液内细菌均匀分布。常规消毒皮肤后,一手顺前臂长轴方向稍压拉皮肤,一手持针筒使针尖斜面朝上,按长轴方向,浅表地刺入皮内(真皮内),为减少组织机械损伤,应缓慢地注入0.1毫升试剂。如注射正确,注射部位产生一扁平高起表面呈橘子皮状的缺血的风团样皮丘,其直径约7毫米。如注射过深,则风团较小,表面呈半球形,而且不呈缺血现象。

三、麻风菌素试验的观察和意义

麻风菌素试验的反应包括红斑、水肿、硬结、大疱、坏死、淋巴管炎和发热等。所有这些表现都反映机体对抗原敏感的程度,决定于使用抗原的种类和剂量。

实践中常见的测量对象是红斑和硬结,后者应用手指触摸确定。用透明尺顺前臂长轴方向记录红斑或硬结直径的毫米数,如有溃疡、水疱等均应记录。每批试验最好由同一人进行观察,或两位观察者的记录作平均数。为避免偏性,观察者以不知测试对象以前的皮试结果和注射内容为佳。

(一)完整麻风菌素(有两种反应)

1.早期反应即Fernandez反应 局部表现主要为红斑水肿。48~72小时达高峰,在此期间测量红斑浸润的直径。(-)<5毫米;(±)5~9毫米;(+)10~14毫米;(++)15~20毫米;(+++)>20毫米。

阳性者的局部病理表现为真皮浅层水肿渗出,毛细血管周围有淋巴细胞浸润,呈非特异性。

2.晚期反应(光田氏反应) 阳性反应为结节性浸润,于一周后出现,3~4周时达高峰。WHO1970年规定注射后21~28天测量局部结节浸润的直径。(-)0;(±)<3毫米;(+)3~5毫米;(++)6~10毫米;(+++)>10毫米或有溃破。

阳性者的病理表现为出现上皮样细胞肉芽肿。强阳性者,中心部出现坏死。

麻风病人的早、晚期反应较一致。晚期反应与麻风病型别关系密切。在瘤型呈阴性,治疗后仍持续阴性,结核样型呈阳性。大多数健康成人晚期反应也呈阳性。完整麻风菌素对麻风临床分型的作用已如上述。但由于这种菌素不能特异性地测定感染情况,因此它在流行病学上无甚价值。一般认为它的早期反应是典型DTH,晚期反应有的认为也是典型的DTH,也有的不以为如此。麻风菌素晚期反应和抵抗力之间的关系尚应进一步研究。

(二)ML可溶性抗原

这类菌素只能激发早期反应。在48~72小时期间测量红斑水肿的直径,按毫米数记录。一般不出现晚期反应。

初步结果表明,瘤型病人对这种可溶性抗原不呈反应,大部分结核样型病人以及相当一部分健康的麻风接触者呈反应。可溶性抗原成功地用于测试死ML疫苗接种后的蛋白质致敏情况。

无论在人或实验动物,上述两种可溶性抗原均与纯蛋白结核菌素(PPD)呈交叉反应,说明这两种抗原均缺乏特异性,因此限制了它在流行病学上的应用。而且对此抗原的活性部分尚不清楚,制备时仅根据总蛋白的浓度做标准,因此每批不一致。这些抗原尚需进一步研究。

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